收到細胞后，首次進行培養(yǎng)，應(yīng)該注意些什么？
收到細胞后最重要的步驟是解凍，但亞洲的客戶無需進行此步驟，因為Invivogen將細胞運往亞洲地區(qū)時使用的是細胞培養(yǎng)板在常溫下運輸。收到細胞后需要立馬進行傳代培養(yǎng)，不要放在-80℃或者液氮中，因為這會損傷細胞。
我在HEK和THP1細胞的初始培養(yǎng)過程中有困難，請問有什么建議可以參考嗎？
如果您在初始培養(yǎng)細胞的過程中遇到任何問題，請參考以下的建議：
●?對于前2-3次傳代的細胞，應(yīng)置于含20%胎牛血清且無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。但此條件下培養(yǎng)細胞時間不宜過長，2-3代之后的細胞應(yīng)使用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
●?請定期檢查細胞狀態(tài)，不要使細胞的匯合度達到100%。
●?當(dāng)凍存細胞時，請繼續(xù)培養(yǎng)其他未凍存的細胞，以防凍存細胞有問題。
如果你正在培養(yǎng)THP1細胞，以下是額外需要注意的地方：
●?對于THP1細胞，我們建議細胞濃度在3 x 105?-7 x 105?cells/mL時進行傳代，一般為5 x 105?cells/mL。如果低于這個濃度，細胞將需要很長時間才能生長，如果高于2 x 106?cells/mL，則可能會產(chǎn)生毒性。
●?在每次傳代之間，請不要使用離心機分離細胞。THP1細胞在條件培養(yǎng)基中生長的會更好，因此當(dāng)傳代時，不要棄去上一代培養(yǎng)細胞時所使用的全部培養(yǎng)基，留1-2 mL，并加入新鮮的培養(yǎng)基。但是原來培養(yǎng)基的占比不能超過50%，因為這樣會導(dǎo)致細胞無法獲得足夠的營養(yǎng)去生長。
為什么要在細胞傳代2-3次之后才可加入篩選抗生素？
由于最初的耐藥標記物水平較低，細胞對篩選抗生素會更加敏感。因此，建議等待2 - 3代后再添加篩選抗生素，以避免在前幾代時對細胞造成進一步的應(yīng)激。
建議用什么血清來培養(yǎng)InvivoGen的細胞?
建議使用無內(nèi)毒素的血清來培養(yǎng)報告細胞系。InvivoGen在培養(yǎng)細胞時，會要求供應(yīng)商提供其所使用血清的COA，以確保低水平的內(nèi)毒素，以免激活NF-kB通路。
細胞培養(yǎng)基中應(yīng)添加多少濃度的青霉素或鏈霉素？
建議使用100 U/mL的青霉素和100 μg/mL鏈霉素。
如果用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中所含的L-glutamine（L-谷氨酰胺）濃度與說明書中不一致會有問題嗎？
沒有問題的，只要培養(yǎng)基中L-谷氨酰胺的濃度不低于2 mM就可以。大多數(shù)DMEM配方中含有4mM的L-谷氨酰胺，但一般情況下培養(yǎng)基中含有2 mM的L-谷氨酰胺即可維持細胞的正常生長。
細胞培養(yǎng)過程中可以使用谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物GlutaMax嗎？
谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物GlutaMax均已通過測試，可以使用，在使用過程中與添加L-谷氨酰胺的細胞相比未發(fā)現(xiàn)有任何差異。
為什么推薦使用熱滅活的血清培養(yǎng)細胞？
許多InvivoGen的細胞系都是通過SEAP（分泌型胚胎堿性磷酸酶）報告系統(tǒng)進行改造的。在很多情況下胎牛血清（FBS）中含有的微量堿性磷酸酶（AP）會干擾檢測結(jié)果。因此，為了降低背景干擾，建議使用滅活血清培養(yǎng)Invivogen的所有細胞。
有滅活胎牛血清（FBS）的操作方法嗎？
實驗室中建議在56℃中加熱30分鐘來滅活血清。滅活時，需要等水浴溫度達到56℃之后再將含血清的試管放入，以確保血清完全滅活。
冷凍培養(yǎng)基必須含有滅活的胎牛血清（FBS）嗎？
實驗時我們通常使用含滅活胎牛血清（FBS）的冷凍培養(yǎng)基，生長培養(yǎng)基及測試培養(yǎng)基。然而，如果您在冷凍培養(yǎng)基中使用非滅活的血清也是沒有問題的。
在培養(yǎng)HEK細胞時沒有貼壁，應(yīng)如何處理呢？
當(dāng)HEK-Blue?細胞沒有貼壁時，要么是開始培養(yǎng)時稀釋過度，要么是在培養(yǎng)瓶中融合過度窒息而死。
以下建議可使您在后續(xù)培養(yǎng)中避免出現(xiàn)這種問題：
●?改變培養(yǎng)基，在T25培養(yǎng)基中以1.5×10^6 cells/mL培養(yǎng)細胞。
●?建議將細胞轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶之前要清洗細胞。有時細胞難以貼壁是因為活細胞與死細胞聚集成簇。已因此清洗細胞以去除影響細胞貼壁的DMSO。
●?使用含20%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。
●?CellBIND表面細胞培養(yǎng)瓶的使用會促進細胞貼壁及生長，然而，一般的細胞培養(yǎng)過程中不需要使用表面細胞培養(yǎng)瓶。
培養(yǎng)THP1細胞時細胞分裂一次需要一周的時間是正常的嗎？
細胞分裂一次需要一周的時間是不正常的。由于細胞克隆的不同，通常情況下THP1細胞分裂一次需要24-72個小時。培養(yǎng)THP1細胞時需保證細胞的濃度大于或等于5 x 105?cells/mL。Invivogen的研發(fā)團隊已經(jīng)注意到當(dāng)稀釋過度時會出現(xiàn)死亡。此外，在等待細胞改善的過程中不要添加Normocin?。
如果THP1細胞在生長過程中出現(xiàn)聚集成團但未死亡應(yīng)該怎么辦呢？
只要細胞生長很好，形態(tài)正常，細胞抱團生長是沒有問題的。因為死細胞的存在可能是導(dǎo)致細胞抱團生長的原因，所以您可以離心去除死細胞。請注意，我們建議您在進行化驗前均質(zhì)細胞。
應(yīng)如何從活細胞中去除死細胞？
推薦使用120 G轉(zhuǎn)速離心10分鐘。
可以提供一些減少HEK-Blue?細胞背景信號的建議嗎?
●?為減少實驗中的背景信號，需在刺激之前一直NF-kB的活性。
●?實驗分析時使用至少傳代24小時的健康細胞。
●?確保細胞的匯合度不超過80%。
●?使用預(yù)熱的PBS清洗細胞。
●?使用滅活的胎牛血清（FBS）培養(yǎng)細胞（清除血清中殘留的堿性磷酸酶）。
●?進行細胞刺激之前不要離心。
●?每個孔板中不要加入過多的細胞（推薦每孔中加入大概50000細胞）。
為什么在檢測培養(yǎng)基中不推薦加入NormocinTM？可以在檢測培養(yǎng)基中添加篩選抗生素嗎？
不建議在檢測培養(yǎng)基中添加NormocinTM是因為在進行檢測時要減少培養(yǎng)基中潛在的干擾因素。因此也不推薦在檢測培養(yǎng)基中添加其他篩選抗生素。
當(dāng)使用數(shù)量相同但傳代數(shù)不同的細胞及濃度相同的配體實驗時，可以得到類似的結(jié)果嗎？
這很難說，因為很難預(yù)測傳代數(shù)對實驗結(jié)果的影響。但是在我們的實驗中使用傳代數(shù)不同的細胞對實驗結(jié)果的影響是非常小的。
Invivogen的細胞系可以用于其它實驗嗎？例如ELISA和Western blotting.
是的，Invivogen的細胞系是可以用于ELISA和Western Blots的。然而，我們沒有做過此類驗證。
Invivogen的細胞系可以用于定量檢測嗎？
它們是半定量測試。然而，它們可以通過使用陽性對照制作標準曲線來用于定量測量。
是否可以將刺激后的上清液冷凍，以便日后讀取/檢測SEAP的產(chǎn)量?
如果您不能立即進行檢測實驗，可將上清樣本儲存于4℃，但儲存時間不可超過一周。如果需要更長時間的儲存，可將其置于-20℃。但在此條件下推薦使用含20%胎牛血清（FBS）的檢測培養(yǎng)基，以在冷凍過程中盡量保護SEAP不受損害，請不要重復(fù)凍融循環(huán)。
如果實驗中需要使用抑制劑處理細胞，是用抑制劑單獨預(yù)處理細胞還是配體與抑制劑共孵育后處理細胞?
這由抑制劑所決定。如果抑制劑阻斷了信號通路中的受體或元素，我們建議將抑制劑與細胞預(yù)孵育至少30分鐘。如果抑制劑結(jié)合或阻斷配體(即針對特定細胞因子的抗體)，那么最好在添加到細胞之前將抑制劑與配體預(yù)孵育。
在刺激之前，細胞需要接種多長時間？
在加入配體時應(yīng)同時接種細胞（先加配體）。
對于貼壁細胞應(yīng)該使用什么冷凍培養(yǎng)基？
對于貼壁細胞，推薦使用DMEM，20%(v/v)的胎牛血清（FBS）和10%(v/v)的DMSO。
對于懸浮細胞應(yīng)該是什么冷凍培養(yǎng)基？
對于懸浮細胞，推薦使用胎牛血清（FBS）和10%的DMSO。
如果凍存步驟未成功，應(yīng)如何處理？
以防出現(xiàn)類似的問題，Invivogen強烈建議在解凍凍存的細胞之前維持培養(yǎng)細胞培養(yǎng)板中未凍存的細胞處于正常生長狀態(tài)。
SEAP的產(chǎn)生需要NF -κB和AP-1轉(zhuǎn)錄因子的激活，還是僅僅激活一個轉(zhuǎn)錄因子就可以得到信號?
Invivogen的報告細胞系僅需要激活一個轉(zhuǎn)錄因子（NFκB 和/或?AP-1）就可以得到信號。
Lucia?熒光素酶來自于什么物種?
InvivoGen的熒光素酶是完全合成的，不屬于任何天然熒光素酶。
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