目前SARS-CoV-2還在全球范圍內(nèi)大流行，感染人數(shù)正在不斷攀升。闡明SARS-CoV-2的感染和尋找治療方法和研發(fā)疫苗至關(guān)重要。InvivoGen最新推出的新冠Spike S1/Nucleocapsid蛋白及Nucleocapsid表達(dá)質(zhì)粒為新冠的研究提供了新工具。

★ 新冠Nucleocapsid表達(dá)質(zhì)粒

SARS-CoV-2 (2019-nCov)核衣殼(N)是一種磷蛋白，與病毒RNA基因組相關(guān)并形成核糖核蛋白核心。這種結(jié)構(gòu)蛋白在病毒生命周期中有著許多重要作用，包括復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和基因組包裝。這些功能由位于N端和C端的兩個主要結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)，分別稱為NTD和CTD。

pUNO1His-SARS2-N和?pUNO1Fc-SARS2-N分別表達(dá)與C-末端His-或Fc-標(biāo)簽融合的密碼子優(yōu)化的核衣殼序列。兩個質(zhì)粒都含有Wuhan-Hu-1分離株的核衣殼編碼序列。pUNO1His-SARS2-N 和?pUNO1Fc-SARS2-N設(shè)計(jì)用于生產(chǎn)和分泌標(biāo)記的核衣殼蛋白。這些質(zhì)粒載體是由強(qiáng)SV40增強(qiáng)子、普遍存在的人EF1α-HTLV復(fù)合啟動子和SV40多聚腺苷酸化(pAn)信號組成的表達(dá)序列。密碼子優(yōu)化的核衣殼編碼序列之前接有外源信號序列，以確保有效的蛋白質(zhì)分泌。在大腸桿菌和哺乳動物細(xì)胞中，這兩種質(zhì)粒都可以被blasticidin篩選。

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圖1.?新冠Nucleocapsid表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖

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★?新冠Spike (S)表達(dá)質(zhì)粒

1.?新冠Truncated Spike (S)表達(dá)質(zhì)粒

Spike是一種在SARS-COV-2表面表達(dá)的結(jié)構(gòu)糖蛋白。它在與宿主受體ACE2結(jié)合時介導(dǎo)膜融合和病毒進(jìn)入靶細(xì)胞以及TMPRSS2的蛋白水解活性。S蛋白由一個N端外域、一個跨膜錨和一個短的C端細(xì)胞質(zhì)尾組成。外域包含編碼受體結(jié)合域(RBD)的S1亞單位，這是針對新冠肺炎的治療和疫苗接種策略中的一個關(guān)鍵靶點(diǎn)，還包含膜融合所需的S2亞單位。

pUNO1-SARS2-S-d19 (D614 或者?D614G)質(zhì)粒編碼來自原始SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1(D614)分離株的Spike編碼序列和具有全球顯性D614G突變(G614-variant)。

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圖2.?新冠Truncated Spike (S)表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖

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2.?新冠Tagged Spike ectodomain (mutated furin site)表達(dá)質(zhì)粒

SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike (S)外域在與受體ACE2結(jié)合時促進(jìn)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，與其他冠狀病毒(如SARS-CoV)不同，SARS CoV-2 S蛋白在S1/S2邊界有一個多元切割位點(diǎn)(681-PRRSR/SVA-688)，該位點(diǎn)包括一個furin切割序列(RxxR) ]。據(jù)推測，由于furin在多種組織中的廣泛表達(dá)，這種furin切割位點(diǎn)的包含可能為SARS-CoV-2的感染提供幫助，從而擴(kuò)大其傳遞性。

pUNO1His-SARS2-S-dfurin和pUNO1Fc-SARS2-S-dfurin質(zhì)粒編碼來自原始SARS-CoV-2 Wuhan?-Hu-1(D614)分離物或與C末端His-或Fc-標(biāo)簽融合的全球顯性D614-變體(D614G)的密碼子優(yōu)化的Spike外域編碼序列。此外，為了在哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和生產(chǎn)沒有切割的全長外域，通過包含兩個突變(R683A和R685A)使furin切割位點(diǎn)失活。

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圖3. 新冠Tagged Spike ectodomain (mutated furin site)表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖

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★ 新冠Nucleocapsid/ Spike S1蛋白

Nucleocapsid是SARS-CoV-2的主要免疫原。據(jù)報(bào)道，新冠肺炎患者血清中抗SARS-CoV-2?N?IgG和IgM抗體滴度升高。Nucleocapsid-His和Nucleocapsid-Fc分別通過將全長SARS-CoV-2?N?[M1-A419]融合到C-末端多聚組氨酸序列和人IgG1 Fc區(qū)而產(chǎn)生。該蛋白序列使用的SARS-CoV-2病毒序列是來自Wuhan-Hu-1 (D614)分離株。

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應(yīng)用范圍：

1.?疫苗接種研究:使用核衣殼蛋白抗原和佐劑的組合

2.?抗體篩查:在新冠肺炎患者血清中發(fā)現(xiàn)抗核衣殼抗體

3.?抑制劑篩選:發(fā)現(xiàn)能夠阻斷SARS-CoV-2核衣殼與復(fù)制-轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(RTCs)相互作用的小分子?

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SARS-CoV-2 (2019-nCoV)刺突蛋白S1亞單位在病毒進(jìn)入靶細(xì)胞中起著至關(guān)重要的作用。S1亞單位具有N端結(jié)構(gòu)域(S1-NTD)和C端結(jié)構(gòu)域(S1-CTD)。S1-NTD被認(rèn)為介導(dǎo)糖結(jié)合，而S1-CTD允許病毒通過受體結(jié)合域(RBD)與ACE2結(jié)合。

Spike-S1-His?和?Spike-S1-Fc分別通過將SARS-CoV-2 Spike S1 [V16-R685]融合到C-末端多聚組氨酸序列和人IgG1 Fc區(qū)而產(chǎn)生。該蛋白使用的SARS-CoV-2病毒序列來自Wuhan-Hu-1 (D614)分離株。

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應(yīng)用范圍：

1.?疫苗接種研究:使用刺突蛋白抗原和佐劑的組合

2.?抗體篩選:尋找能夠中和SARS-CoV-2感染的抗刺突蛋白抗體

3.?抑制劑篩選:尋找能夠阻斷SARS-CoV-2?RBD與ACE2受體相互作用的小分子或抗體

4. 在原代細(xì)胞或轉(zhuǎn)染細(xì)胞中篩選表達(dá)ACE2的細(xì)胞

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