人腫瘤壞死因子TNF-α簡介：

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α , TNF-α)是一種具有多功能的細胞因子，在炎癥反應(yīng)、細胞免疫、細胞凋亡和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。人 TNF-α前體由 233 個氨基酸組成(26 kDa)，其中包含由76 個氨基酸殘基組成的信號肽，在 TNF 轉(zhuǎn)化酶 TACE 的作用下，切除信號肽，形成成熟的 157 個氨基酸殘基的 TNF-α(17 kDa)。在胞外結(jié)構(gòu)域中，人 TNF-α與恒河猴的氨基酸序列具有 97%的同一性，與牛、犬、棉鼠、馬、貓、小鼠、豬和大鼠 TNF-α序列具有 71%-92%的同一性。TNF-α來源極廣泛，體內(nèi)多種細胞如單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、內(nèi)皮細胞和角質(zhì)細胞等均可產(chǎn)生和釋放 TNF-α。TNF 受體有 2 種，I 型(TNFR1)分子量為 55 kD，Ⅱ型(TNFR2)為 75 kD，在多種細胞中表達，介導(dǎo)細胞凋亡的主要是 TNFR1。TNF-α以三聚體的形式與靶細胞上 3 分子 TNFR 結(jié)合而使受體激活。

TNF-α具有廣泛的生物學(xué)活性，可以殺傷或抑制腫瘤細胞，誘導(dǎo)正常細胞增殖分化，抗感染，促進 IL-1、IL-2 和 IL-6 的產(chǎn)生和分泌，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，激活嗜中性粒細胞，調(diào)節(jié) MHCⅡ類抗原的表達，提高中性粒細胞的吞噬能力。TNF-α也參與許多病理過程，包括哮喘、克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)病理性疼痛、肥胖、2 型糖尿病、感染性休克、自身免疫和癌癥等。

試劑盒組成：

儲存條件：

檢測原理:

欣博盛 QuantiCyto? ELISA試劑盒采用雙抗體夾心法：抗人TNF-α單抗包被于酶標板上，標本和標準品中的人TNF-α?xí)c單抗結(jié)合，游離的成分被洗去。加入生物素化的抗人TNF-α抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素，生物素與親和素特異性結(jié)合；抗人TNF-α抗體與結(jié)合在單抗上的人TNF-α結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應(yīng)孔中有人TNF-α，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑現(xiàn)藍色，加終止液變黃。在450 nm處測OD值，人TNF-α濃度與OD450值之間呈正比，可通過繪制標準曲線求出標本中人TNF-α的濃度。

試驗所需自備試驗器材 (不提供，但可協(xié)助購買) :

1. 酶標儀(450 nm波長濾光片)

2. 進口品牌高精度加液器及一次性吸頭：0.5-10 ul, 2-20 ul, 20-200

ul, 200-1000 ul。

3. 37 ℃恒溫箱, 雙蒸水或去離子水，坐標紙等。

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標本收集:

1. 收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。

2. 血漿抗凝劑推薦使用EDTA。避免使用溶血，高血脂標本。

3. 標本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

4. 標本收集后若不及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20 ℃，-70 ℃電冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融，3-6月內(nèi)檢測。

5. 如果您的樣本中檢測物濃度高于標準品最高值，請根據(jù)實際情況，做適當倍數(shù)稀釋(建議做預(yù)實驗，以確定稀釋倍數(shù))。?

注意事項:

1. 試劑盒使用前請保存在2-8 ℃。復(fù)溶后的標準品若未用完，請廢棄。

2. 濃縮生物素化抗體，濃縮酶結(jié)合物體積小，運輸中顛簸和可能的倒置，會使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。

3. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,屬于正?，F(xiàn)象，微加熱至40℃使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液。（加熱溫度不要超過50 ℃）使用時洗滌液應(yīng)為室溫。

4. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應(yīng)終止液除外）。請?zhí)崆白稍冃啦┦⑸锟萍加邢薰尽?/p>

5. 充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用最低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。

6. 在試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙孔檢測。

7. 試驗中所用的試管和吸頭均為一次性使用，嚴禁在不同的液體之間混用！否則將影響試驗結(jié)果。

8. 試驗中請穿著試驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液標本時，請按國家生物試驗室安全防護條列執(zhí)行。

9. 如果分次使用，請根據(jù)需要量配制各組分，以免配制過多造成浪費而影響后續(xù)試驗。剩余板孔請用封板膠紙封住，放回鋁箔袋中,2個月內(nèi)用完。

檢測前準備工作:

1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。

2. 用雙蒸水將20×濃縮洗滌液稀釋成1×工作液。未用完的放回4 ℃。

3. 標準品: 開蓋前1000rpm離心1min。加入標準品&標本通用稀釋液1.0 ml至凍干標準品中，靜置15分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為1000 pg/ml)。然后根據(jù)需要進行稀釋。(建議標準曲線使用以下濃度：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。0 pg/ml即空白孔。復(fù)溶標準品原液(1000 pg/ml）若未

用完的請廢棄。

4. 生物素化抗體工作液：按當次試驗所需要得用量，使用前20分鐘，用生物素化抗體稀釋液將30×濃縮生物素化抗體稀釋成1×工作液。當日使用。若實驗次數(shù)過多導(dǎo)致生物素化抗體量不足，可向欣博盛公司單獨購買生物素化抗體。（須提供抗體批號）

5. 酶結(jié)合物工作液：按當次試驗所需要的用量，使用前20分鐘，用酶結(jié)合物稀釋液將30×濃縮酶結(jié)合物稀釋成1×工作液。當日使用。

若實驗次數(shù)過多導(dǎo)致濃縮酶結(jié)合物量不足，可向欣博盛公司單獨購買濃縮酶結(jié)合物。（須提供酶結(jié)合物批號）

標準品稀釋方法圖例：

以500 ul/管為例，用標準品&標本通用稀釋液將復(fù)溶后的標準品母液進行倍比稀釋，具體稀釋方法如下圖，也可根據(jù)實際用量來稀釋，如200 ul/管。

洗滌方法:

1. 自動洗板機：要求注入的洗滌液為350 ul，注入與吸出間隔30－60秒。洗板5次。

2. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350 ul，靜置30秒后甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干。洗板5次。 操作步驟:

1．從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內(nèi)壓實自封條，密封口袋，放回4 ℃。

2．空白孔加標準品&標本通用稀釋液，其余相應(yīng)孔中加標本或不同濃度標準品(100 ul/孔)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育90分鐘。

3．提前20分鐘準備生物素化抗體工作液。

4．洗板5次。

5．空白孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液(100 ul/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育60分鐘。

6．提前20分鐘準備酶結(jié)合物工作液。避光室溫(22-25 ℃)放置。

7．洗板5次。

8．空白孔加酶結(jié)合物稀釋液，其余孔加入酶結(jié)合物工作液(100 ul/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育30分鐘。

9．打開酶標儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測程序。

10．洗板5次。

11．加入顯色底物(TMB)100 ul/孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育15分鐘。

12．加入反應(yīng)終止液100 ul/孔, 混勻后即刻測量OD450值(3分鐘內(nèi))。在儀器保存讀數(shù)結(jié)果并打印一份紙質(zhì)結(jié)果。

13. 實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回電冰箱保存至有效期結(jié)束。

建議保存酶標板框，以備下次或者今后試驗使用。

結(jié)果判斷:

1. 每個標準品和標本的OD值應(yīng)減去空白孔的OD值。

2. 以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，手工繪制或用軟件繪制并選取最佳擬合曲線，推薦使用二次多項式方程擬合。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

3. 若標本OD值高于標準曲線上限，應(yīng)適當稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

靈敏度、特異性和重復(fù)性:

● 靈敏度：最小可測人TNF-α達7.8 pg/ml(8次獨立重復(fù)實驗平均值)。

● 特異性：本試劑盒特異性識別天然和重組人TNF-α。與以下細胞因子等無明顯交叉反應(yīng)。

● 重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%。

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