由于神經(jīng)退行性疾病的復雜成因，目前臨床上尚缺乏有效的治療方案，甚至對疾病病理進程也未完全了解。在研究 AD 的過程中，最先引起科研學者們注意的相關(guān)蛋白是?β?淀粉樣肽，其出現(xiàn)在 AD 患者的大腦斑塊中，被認為是導致神經(jīng)元變性甚至死亡的原因[2]。因此最初的藥物和治療方案都是針對該蛋白，但令人失望的是，這些新藥研發(fā)全軍覆沒。于是國內(nèi)外更多的研究重點又放在了 tau 蛋白上。
不過，隨著越來越深入的研究，科研學者們發(fā)現(xiàn)?AD 可能不是單純由某一個蛋白致病，而是兩種蛋白同時出現(xiàn)問題共同導致的疾病進程[3]，所以，科研學者決定重新對?β?淀粉樣肽開展研究。
從結(jié)構(gòu)和機制上來說，β?淀粉樣肽簡稱 Aβ，是淀粉樣肽前體蛋白（APP）的水解產(chǎn)物。APP 則是一種跨膜整合蛋白，存在于多種組織當中，尤其是在 AD 中有重要角色的神經(jīng)元突觸[4]。APP 蛋白水解之后釋放 Aβ，而后聚集沉積，是淀粉樣斑塊的主要成分。Aβ?和 tau 蛋白以及?α?突觸核蛋白都有類似的蛋白聚集機制，從單體到寡聚體再到原纖維，然后像種子一樣誘導更多單體形成原纖維/聚集體。
從形式和特性上來說，Aβ?肽是單體，主要有兩種形式?Aβ40??和 Aβ42，前者在正常老年人和?AD?患者腦中含量豐富，而后者主要存在于?AD?患者腦中[5]。Aβ42 非常不穩(wěn)定且極其容易聚集，導致研究它的各種結(jié)構(gòu)（單體、寡聚體、原纖維）非常困難[6]。由于 Aβ1-42?在水溶液中是無結(jié)構(gòu)的，而非極性溶劑可以誘導?α?螺旋結(jié)構(gòu)[7]，所以目前市面上常用的是 HFIP（1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇，一種非極性溶劑）處理的 Aβ?肽，使之穩(wěn)定于單體狀態(tài)。當 HFIP 中水的含量增加時，α?螺旋開始變成?β?折疊[7]，也就是聚集過程的開始，因此 Aβ?單體在運輸和儲藏過程中是干粉狀態(tài)，需要防潮，避免水份的加入。
StressMarq?的?β?淀粉樣肽?1-42（Aβ42）為合成肽，在干燥前用??HFIP?處理，從而可以分解前體原纖維并使肽單體化，一些文獻中也使用該方法[8,9]。在 DMSO/dH2O 中重新懸浮后，當在 TEM、AFM 和具有抗 Aβ 抗體的蛋白質(zhì)印跡下觀察時，Aβ42 呈現(xiàn)為不含原纖維的單體肽。值得注意的是，與 Aβ42 寡聚體和原纖維相比，Aβ42 單體對原代大鼠皮層神經(jīng)元沒有毒性。
圖 1. 從左至右分別為 Aβ?單體（SPR-485），寡聚體（SPR-488）和原纖維（SPR-487）的電鏡圖。負染色透射電子顯微鏡圖像在 80 Kv 下在碳涂層的 400 目銅網(wǎng)格上使用磷鎢酸和乙酸雙氧鈾染色獲得。比例尺 = 100 nm。
圖 2. 從左至右分別為 Aβ?單體（SPR-485），寡聚體（SPR-488）和原纖維（SPR-487）的原子力顯微鏡圖。將 1.0 mg/mL 樣品在 dH2O 中稀釋至 0.1 mg/mL 置于新鮮切割的云母上，清洗、干燥并以輕敲模式進行原子力顯微鏡分析。上圖為 2.5 x 2.5 μm x-y，z 范圍為 10 nm。淀粉樣斑塊的出現(xiàn)一直被認為是 AD 疾病的象征，但是它出現(xiàn)的數(shù)量和節(jié)奏都與 AD 疾病的進程不符，所以近年來，研究學者們發(fā)現(xiàn)推動疾病進程更多的可能是 Aβ?寡聚體和原纖維。制作寡聚體和原纖維的步驟在很多文獻都有描述[8~10]，以下圖表為常用的處理方法：
圖 3. Aβ?寡聚體和原纖維制作流程[10]
StressMarq 的 Aβ42 寡聚體使用 Aβ?肽由特殊方法制得，F(xiàn)12 細胞培養(yǎng)基方法也在投入生產(chǎn)。Aβ42 寡聚體在電子顯微鏡（圖 1）和原子力顯微鏡（圖 2）下顯示出明顯的球狀結(jié)構(gòu)，而在 WB（圖 4）中使用抗 Aβ?抗體顯示出獨特的二聚體/三聚體和寡聚體信號。同時?Aβ?寡聚體對原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元有毒性（圖?5）。Aβ42 原纖維使用 Aβ?肽由 HCl 方法制得，在電子顯微鏡（圖 1）和原子力顯微鏡（圖 2)下顯示出明顯的長鏈狀結(jié)構(gòu)，而在 WB（圖 4）中使用抗 Aβ?抗體顯示出獨特的高分子量信號。同時?Aβ?原纖維對原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元有毒性（圖?5）。
圖 4. 從左至右分別是 Aβ?單體（SPR-485），寡聚體（SPR-488）和原纖維（SPR-487）的 WB，抗體是抗 Aβ6E10?抗體。三種 Aβ?蛋白（160 pmol）在 4%~12% Bis-Tris SDS-PAGE 上跑膠后，在 0.02% v/v Tween-20 存在下轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上，并用 1:1000 小鼠 6E10 一抗做 WB。在 TEM/AFM 下觀察到的寡聚體顯示出明顯的二聚體/三聚體條帶以及來自 ~37-75 kDa 的信號（中）。在 TEM/AFM 下觀察到的原纖維顯示出大于 100 kDa 的信號，并且在濃縮膠（右）中有明顯的信號。
圖 5. Aβ 1-42 寡聚體（SPR-488）和原纖維（SPR-487）對原代大鼠皮層神經(jīng)元顯示出劑量依賴性毒性，但單體（SPR-485）沒有毒性。大鼠原代皮層神經(jīng)元用不同濃度的（A）單體、（B）寡聚體或（C）原纖維處理 14 天后的存活率，由 MAP2 陽性神經(jīng)元量化并表示為對照的百分比（空白對照設(shè)為 100%）。原纖維和相應(yīng)的載體對照先在 Bioruptor 超聲破碎儀中進行超聲處理。測試條件在與未處理的對照和載體對照相同的板中運行，由不含 Aβ 1-42 蛋白的緩沖液組成。數(shù)據(jù)表示為平均值 +/- s.e.m.（n = 6）。使用單向方差分析和 Dunnett 檢驗對數(shù)據(jù)進行全局分析；**?p?p?p?
總的來說，StressMarq 的 Aβ 單體、寡聚體和原纖維都可以應(yīng)用于 WB，以及體內(nèi)和體外實驗。StressMarq 的 Aβ 寡聚體在毒性方面有潛力成為更好的建模工具，更多數(shù)據(jù)或產(chǎn)品詳情，可聯(lián)系一級代理商-欣博盛生物
參考文獻：
[1].?https://www.bjnews.com.cn/detail/160067807215569.html
[2].?Shankar, G.M. et al. Amyloid-b protein dimers isolated directly from Alzheimer’s brains impair synaptic plasticity and memory. Nat Med. 2008 Aug;14(8):837-42.
[3].?Eisenberg, D.S. and Sawaya, M.R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annu. Rev. Biochem. 2017. 86:69–95.
[4].?Chen, G.F. et al. Amyloid beta: structure, biology and structure-based therapeutic development. Acta Pharmacol Sin. 2017 Sep;38(9):1205-1235.
[5].?Qiao L, Sun Y, ?Qu Z. Research situation of tau proteins and β-amyloid protein in the pathological process and autophagic mechanisms in Alzheimer′s disease. Chin J Diagnostics(Electronic Edition), 2019,7(2): 94-97.
[6].?LeVatte,M.A. et al. Preparation and characterization of a highly soluble Aβ1-42 peptide variant. Protein Expr Purif. 2019 Dec;164:105480.
[7].?Zhang-Haagen, B. et al. Monomeric Amyloid Beta Peptide in Hexafluoroisopropanol Detected by Small Angle Neutron Scattering. PLoS One. 2016; 11(2): e0150267.
[8].?Stine et al. In Vitro Characterization of Conditions for Amyloid-β Peptide Oligomerization and Fibrillogenesis.2003. JBC. 278(13):11612-22.
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[10].?Dahlgren, K.N.. et al. Oligomeric and Fibrillar Species of Amyloid-β?Peptides Differentially Affect Neuronal Viability.?J Biol Chem. 2002 Aug 30;277(35):32046-53.
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