一、熒光知識

熒光素按激發(fā)光波長來分，主要是激發(fā)波長為375 nm、405 nm、488 nm和633 nm 4類，其中，常用的是激發(fā)波長為488 nm和633 nm的熒光素，如FITC、PE、APC、PI等。

激發(fā)波長為488nm的熒光素

1) 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）：FITC是應用最為廣泛的一種熒光素，經(jīng)激光激發(fā)后發(fā)出明亮的黃綠色熒光，最大發(fā)射波長為525 nm。FITC的熒光強度受PH影響較大，常隨著PH的降低而減弱，因此，在使用FITC時需格外注意溶液的酸堿度。

2) Alexa Fluor 488：Alexa Fluor是美國分子探針公司開發(fā)的系列熒光染料，Alexa Fluor 488的發(fā)射光譜與FITC幾乎一致，經(jīng)激光激發(fā)后發(fā)出綠色熒光，最大發(fā)射波長為519 nm，但其熒光強度和穩(wěn)定性要優(yōu)于FITC。一般來說，Alexa Fluor 488在pH 4-10范圍內能保持較好的光穩(wěn)定性。

3) 藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）：PE是從紅藻中分離純化獲得的一種常見染料，經(jīng)激光激發(fā)后發(fā)出橙黃色熒光，最大發(fā)射波長為575 nm。PE具有吸光性能好和光量子產(chǎn)率高的特點，可用于標記表達水平較低的蛋白。在流式細胞術檢測中，PE標記的抗體適用于所有配備488 nm氬離子激光器的流式細胞儀。

4) PE-Cy5：PE-Cy5是一種復合染料，屬于藻紅蛋白偶聯(lián)物，在此類復合染料中，激發(fā)能量可從PE傳遞到Cy5上，最大發(fā)射波長為667 nm。由于PE-Cy5與FITC、PE在光譜上重疊范圍較少，熒光干擾少，因此實驗中常將PE-Cy5與FITC、PE搭配使用。需注意，PE-Cy5不適合與APC搭配使用，兩者熒光重疊大。

5)PE-Cy5.5：PE-Cy5.5也是一種復合染料，能量從PE傳遞到Cy5.5上，最大發(fā)射波長為694 nm。同PE-Cy5不一樣，PE-Cy5.5與FITC、PE、APC間熒光干擾小，可搭配使用，且其熒光強度要優(yōu)于PE-Cy5。

6) PE-Cy7：復合染料，最大發(fā)射波長為785 nm。PE-Cy7與FITC無光譜重疊，與APC重疊也較少，因此其可與FITC、PE、APC搭配使用。在實驗中需要注意，PE-Cy7的光淬滅性很強，需要絕對避光環(huán)境。

7) PerCP-Cy5.5：復合染料，最大發(fā)射波長為695 nm。與PerCP相反，PerCP的光量子產(chǎn)率較低，適用于表達水平較高物質的檢測，PerCP-Cy5.5光量子產(chǎn)率高，可用于表達水平較低物質的檢測。在雙激光管儀器上與APC共同檢測時，需要做補償調節(jié)，但比PerCP補償少。

8) PI/7-AAD：碘化丙啶（propidium iodide，PI）和7-AAD（7-amino-actinomycin D）的最大發(fā)射波長分別為617 nm和647 nm，是常見的熒光染料，常用于細胞凋亡檢測，可用于鑒別死、活細胞。在大部分流式細胞儀上，PI在FL2或FL3通道檢測，7-AAD在FL3通道檢測。7-AAD同PI 有著相似的熒光特性，但其發(fā)射波譜較PI窄，對其他檢測通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的最佳替代品。

激發(fā)波長為633nm的熒光素

1) 別藻青蛋白（allophycocyanin，APC）：APC最大發(fā)射波長為660 nm，其標記的抗體適用于所有配備氦氖激光器的流式細胞儀，檢測通道一般是FL4通道。FITC、PE和APC搭配是經(jīng)典3色搭配。

2) Cy5：Cy5屬于小分子染料，其最大發(fā)射波長為670 nm，其標記的抗體適用于所有配備633 nm氬離子激光器的流式細胞儀，檢測通道一般是FL4通道。除流式細胞術外，Cy5同樣適用于傳統(tǒng)的熒光顯微鏡技術。需注意的是，Cy5與單核細胞和粒細胞的非特異性結合多，實驗結果容易出現(xiàn)假陽性。

3) Alexa Fluor 647：Alexa Fluor 647是一種明亮的紅色熒光染料，其最大發(fā)射波長為668 nm，一般在流式細胞儀的FL4通道檢測。Alexa Fluor 647具有熒光量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好、適宜的pH范圍廣和不易淬滅等特點，是APC和Cy5的優(yōu)質替代品。

二、熒光素的選擇

在流式細胞術實驗，各種熒光素標記的抗體是必不可少的。那么熒光素該如何選擇呢，通常會參考以下5個方面：

1. 流式細胞儀配置：儀器需滿足激光管可激發(fā)相應的熒光素且可同時檢測所需的熒光。附常見熒光素的激發(fā)波長和發(fā)射波長：

2. 染料的亮度與抗原表達量相匹配：低表達抗原，推薦使用亮熒光染料；高表達抗原，推薦使用弱熒光染料。

3. 熒光染料重疊最小化：盡量選擇光譜重疊小的熒光素，如FITC/PE-Cy7；選擇不同激光激發(fā)的熒光素，如FITC/APC，PE/APC。

光譜重疊嚴重的熒光素同時檢測會導致熒光溢漏，需調節(jié)補償。

4. 避免復合染料聯(lián)合使用帶來的假陽性：常見的復合染料有PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、APC-Cy7等，復合染料的信號衰退會降低APC或PE的靈敏度。如果出現(xiàn)信號衰退，則：

● 減少樣本暴露于光、高溫或固定劑；

● 選擇染料時考慮：復合染料的信號衰退會降低APC或PE的靈敏度，避免染料和其衍生物在同一細胞上標記。選擇更穩(wěn)定的tandem-dye（PerCp-Cy5.5）；

● 如果樣本需固定，選擇穩(wěn)定、可有效阻止復合染料信號衰退的固定劑多聚甲醛：冰上固定10min，離心除去多聚甲醛，將樣品重懸于PBS中。

5. 盡量使用紅色激光激發(fā)自發(fā)熒光高的樣本：每種細胞群都有不同水平的自發(fā)熒光。所有的熒光通道均可觀察到自發(fā)熒光，但自發(fā)熒光強度在波長較長時迅速降低。對自發(fā)熒光較強的細胞，選擇紅光激發(fā)，發(fā)射波長長的熒光素（如APC）可得到較好的S/N比值；對自發(fā)熒光比較弱的細胞，發(fā)射波長長的熒光素對S/N提高沒有明顯的改善，可選用FITC。

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