該免疫組化實(shí)驗(yàn)方法僅供參考，由于每個(gè)實(shí)驗(yàn)使用的試劑不同，并且涉及不同的物種，組織類(lèi)型及實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)人員設(shè)計(jì)應(yīng)根據(jù)具體情況設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟和改良。
所需試劑
丙酮
乙醇，無(wú)水變性的，組織學(xué)分級(jí) (100% 和 95%)
蒸餾水
蘇木精
二甲苯
10X TBS: 制備 1 升10X TBS：24.2g Tris base, 80g NaCl; 用HCl (使用 1X) 將pH 調(diào)至 7.6 。
洗滌液 TBS/T: 1X TBS, 0.1% Tween-20: 制備 1 升需將100ml 的 10x TBS 加入到 900 ml 雙蒸餾水中。加入1ml Tween 20 然后混合。
10 mM 檸檬酸鈉緩沖液： 制備 1 升需將 2.94g 檸檬酸鈉加入到 1 升的蒸餾水中。將 pH 調(diào)至 6.0。
3% 過(guò)氧化氫： 制備需將10ml 30% H2O2?加入到 90ml 蒸餾水中。
封閉液: 5% 馬血清或山羊血清溶于TBS
ABC 試劑: 在使用前30分鐘根據(jù)制造商說(shuō)明制備。
DAB 試劑: 根據(jù)制造商說(shuō)明制備。
組織制備
A. 新鮮冷凍切片
組織制備
在液氮中將組織切成小塊 (5 mm x 5 mm x 3 mm)。
轉(zhuǎn)移到恒冷箱切片機(jī)中, 切成5–30 μm薄的切片，將切片轉(zhuǎn)移至帶正電荷的載玻片上 (poly-L-lysine 包被的).
室溫下干燥切片 (若當(dāng)天染色則干燥1-2 小時(shí)，直至完全干燥)。注意：徹底干燥才能保證組織恰當(dāng)?shù)卣掣皆谇衅稀?/span>
固定方法
可用的固定方法有很多種. 應(yīng)遵循產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上指定的方法或找到適宜樣品的最佳方案。
用PBS （pH 7.4 含1% Tween 20）漂洗切片3次，每次5分鐘。
B. 固定的, 冷凍組織切片
使組織充滿固定劑或?qū)⒔M織浸入到固定劑中一段時(shí)間。最常用的固定劑是4% 多聚甲醛。
將組織浸沒(méi)于凍存保護(hù)液（其中含有含10-30%蔗糖的PBS）中。當(dāng)組織沉入溶液中后凍存保護(hù)就完成了。
從凍存保護(hù)液中取出組織，保存于 -70°C 直到切片。
將組織從 -70°C 冰箱取出，在-20°C平衡15分鐘 然后再切片。-20°C平衡幫助避免切片時(shí)的斷裂。
用恒冷箱切片機(jī)將組織切成 10-15um 的切片，收集切片置于載玻片上。通常每個(gè)載玻片可以放置3片切片，留出足夠間距。
充分干燥切片?？墒褂米匀伙L(fēng)干或切片加熱器，通常需要過(guò)夜或在40-50°C下至少干燥2~3小時(shí)。
制好的切片可以干燥保存在 -70°C 直至染色。 在復(fù)水染色前要先平衡至室溫并適當(dāng)干燥。
C. 石蠟包埋切片
脫蠟和水化切片
二甲苯：換 2-3 次，每次5分鐘。
100% 純乙醇：換2次，每次3分鐘。
95% 乙醇: 換2次，每次3分鐘。
80% 乙醇：3分鐘。
50% 乙醇：3分鐘。
蒸餾水，PBS，或 Tris buffer：換2次，每次3分鐘。
注意: 一旦組織切片復(fù)水，不要使之干透。用吸水紙吸干組織切片周?chē)Ｓ勉@石劃針，免疫組化筆，陶瓷記號(hào)筆, 或指甲油在載玻片上將切片圈起來(lái)。這個(gè)圈可以在接下來(lái)的孵育過(guò)程中使溶液留存于切片上。
抗原修復(fù)
很多抗原的可視性可以通過(guò)抗原修復(fù)來(lái)提高，抗原修復(fù)可以打破福爾馬林固定時(shí)形成的蛋白質(zhì)交聯(lián)，從而使被掩藏的抗原顯現(xiàn)出來(lái)?？乖迯?fù)技術(shù)包括不同時(shí)間長(zhǎng)度的加熱或者利用蛋白酶來(lái)做酶消化，例如蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。
加熱的方法通常會(huì)用到微波爐，高壓鍋，蒸箱或水浴。將樣品在接近100°C高溫加熱20分鐘后再冷卻同等的時(shí)間。最常用的抗原修復(fù)液有 a) 檸檬酸鹽緩沖劑, pH 6.0, b) Tris-EDTA, pH 9.0 和 c) EDTA, pH 8.0.
如需要可用檸檬酸鹽緩沖劑做抗原修復(fù)：
檸檬酸鹽緩沖劑配方:
10mM 檸檬酸鈉, 0.05% Tween-20, pH 6.0 或
10mM 檸檬酸, 0.05% Tween-20, pH 6.0
將含有檸檬酸鈉或檸檬酸鹽緩沖劑的染色盤(pán)放到蒸箱或者水浴中，預(yù)熱到95-100 °C。
將切片浸沒(méi)于染色盤(pán)中。蓋子虛掩，孵育20-40 分鐘 (研究者需自己決定最佳的孵育時(shí)間)。
關(guān)掉蒸箱或水浴，將染色盤(pán)置于室溫下，讓切片冷卻20分鐘。
在TBS-Tween-20中漂洗切片2次，每次2分鐘。
開(kāi)始封閉步驟。
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過(guò)氧化氫孵育
阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶 (如需要):
1.將切片浸入到 0.3-3% H2O2 和 100% 甲醇中，室溫下10-30 分鐘。
2.在蒸餾水中漂洗切片，換2次，每次5分鐘。
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免疫組化實(shí)驗(yàn)方案
封閉步驟:
用3-10% 來(lái)自二抗宿主物種的正常血清孵育切片30分鐘，以阻斷非特異的抗體結(jié)合。
移去封閉液。
一抗孵育
*所有步驟需在濕潤(rùn)的環(huán)境中進(jìn)行。
在封閉液中稀釋一抗。如果沒(méi)有建議的稀釋度，從 1:10, 1:100 和 1:1000開(kāi)始。
4°C 孵育過(guò)夜。
移去抗體溶液。用PBS，pH 7.4 洗滌3次，每次5分鐘。
如果一抗是HRP-標(biāo)記的，直接開(kāi)始顯色步驟。
二抗孵育
根據(jù)建議的稀釋度在封閉液中稀釋生物素-標(biāo)記的二抗。室溫下孵育 30-60 分鐘。
移去二抗溶液。在洗滌液中清洗3次，每次5分鐘。
顯色
向每個(gè)切片中加入鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶試劑，室溫下孵育30分鐘。
移去 ABC 試劑。用洗滌液清洗切片3次，每次5分鐘。
在濕潤(rùn)的環(huán)境下用 DAB 溶液徹底覆蓋切片。室溫下孵育 5-15 分鐘?；蛘?，在顯微鏡下觀察切片來(lái)決定最佳的不溶沉淀物顏色深度。
一旦顯色，用蒸餾水小心沖洗以終止反應(yīng)。
如需要可以用蘇木精和曙紅對(duì)組織進(jìn)行復(fù)染色。
用蒸餾水清洗切片。
復(fù)水以及加蓋玻片
樣品復(fù)水：使用一系列不同濃度的甲醇或乙醇- 50% (2 x 5 min), 75% (2 x 5 min), 最后 100% (2 x 5 min)。
用二甲苯重復(fù)上述步驟，孵育切片兩次，每次10秒鐘。
使切片自然干燥。
用合適的固定介質(zhì)固定好蓋玻片。
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