CUT&RUN的8個(gè)基本步驟

CUT&RUN只包含幾個(gè)基本步驟！

具體信息請見下方~

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步驟1：分離細(xì)胞并固定到刀豆蛋白（ConA）磁珠上

將細(xì)胞（或細(xì)胞核）與ConA包被的磁珠結(jié)合，ConA是一種與細(xì)胞表面蛋白結(jié)合的凝集素。該步驟不僅支持高通量方法，而且簡化了后續(xù)從染色質(zhì)片段里分離細(xì)胞的操作。

避免磁珠干燥或結(jié)塊在本步驟中非常重要，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致樣品損失并降低產(chǎn)量。關(guān)于確認(rèn)細(xì)胞完整性及與ConA磁珠結(jié)合情況的重要質(zhì)量控制檢查信息，可以點(diǎn)擊此處獲取。除此之外，高質(zhì)量的樣本準(zhǔn)備對CUT&RUN的成功也至關(guān)重要，某些類型的樣本可能需要進(jìn)行一定處理后方可使用，詳情可點(diǎn)擊Sample Prep查詢。

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步驟2：透化細(xì)胞

由于洋地黃皂苷是一種非離子生物洗滌劑，可在低濃度下透化細(xì)胞膜。因此，在本步驟中使用含有洋地黃皂苷的緩沖液對固定好的細(xì)胞進(jìn)行透化處理。透化處理對于抗體與pAG-MNase的結(jié)合至關(guān)重要，并且為后續(xù)MNase消化獲得的DNA能夠擴(kuò)散到溶液中提供先決條件。洋地黃皂苷的用量必須根據(jù)所用細(xì)胞的類型進(jìn)行優(yōu)化，以免在實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞出現(xiàn)裂解或不完全透化的情況，關(guān)于優(yōu)化處理的詳細(xì)信息，請點(diǎn)擊此處了解。

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步驟3：加靶標(biāo)特異性抗體孵育

將目標(biāo)靶標(biāo)的抗體添加到反應(yīng)中，并在4℃下孵育過夜。我們建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)中設(shè)置陰性對照（如IgG）和陽性對照（如H3K4me3）反應(yīng)。

抗體的特異性和結(jié)合效率對于CUT&RUN的成功至關(guān)重要。事實(shí)上，這種檢測的背景非常低，以至于低效率的抗體無法達(dá)到足夠高的產(chǎn)量進(jìn)行PCR和測序。相反，非特異性抗體可能會(huì)提供相當(dāng)好的產(chǎn)量，但會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的生物學(xué)解釋。詳情參考抗體選擇和檢測控制的附加說明。

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步驟4：pAG-MNase結(jié)合

第二天，洗滌與磁珠結(jié)合的細(xì)胞，除去未結(jié)合及非特異性結(jié)合的抗體。在沒有鈣離子（Ca2+）存在的條件下，將pAG-MNase添加到反應(yīng)體系中，以防止MNase的過早激活。pAG的免疫球蛋白結(jié)合特性會(huì)將MNase“栓”在抗體結(jié)合的染色質(zhì)上。pAG-MNase孵育后，多次洗滌細(xì)胞/磁珠混合物，以去除過量的pAG-MNase，防止非特異性切割。

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步驟5：pAG-MNase激活

向反應(yīng)中加入Ca2+以激活MNase，MNase會(huì)在抗體結(jié)合處的兩側(cè)切割DNA。被切割下來的片段擴(kuò)散至上清液中，而剩余的大塊染色質(zhì)保留在磁珠固定的細(xì)胞內(nèi)。

由于MNase是一種加工酶，所以必須終止反應(yīng)，以防止釋放的DNA片段被過度消化掉。pAG-MNase孵育后，加入含有EDTA和EGTA的Stop緩沖液以螯合游離鈣離子并終止酶活性。短暫加熱反應(yīng)體系以降解RNA，并將剩余的染色質(zhì)片段釋放至溶液中。

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步驟6：DNA純化

因?yàn)榧?xì)胞仍與磁性ConA珠結(jié)合在一起，所以CUT&RUN富集DNA的分離很簡單。利用磁性，將含有大量染色質(zhì)的磁珠偶聯(lián)細(xì)胞與剪切下的目標(biāo)DNA片段分離開，目標(biāo)DNA被留在溶液中。目標(biāo)DNA片段純化后，通過熒光測定（例如ThermoFisher QubitTM）進(jìn)行定量。

DNA產(chǎn)量一般不作為表明CUT&RUN成功的指標(biāo)，相反，當(dāng)目標(biāo)是~5 ng DNA時(shí)，后續(xù)CUT&RUN文庫制備的效率較高。由于原始的CUT&RUN?DNA產(chǎn)量通常低于Bioanalyzer?/ TapeStation的檢測極限，所以不建議使用這些方法在Bioanalyzer?/ TapeStation上分析原始的CUT&RUN?DNA。

EpiCypher還檢測了陽性對照和實(shí)驗(yàn)靶標(biāo)高于IgG陰性對照反應(yīng)的產(chǎn)量（即使只是略高）。根據(jù)概述的指標(biāo)確認(rèn)好DNA質(zhì)量后，即可進(jìn)行下一步的文庫構(gòu)建。

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步驟7：CUT&RUN文庫構(gòu)建

將修復(fù)純化的CUT&RUN DNA連接到測序adapter上，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增以生成測序文庫。PCR擴(kuò)增使用了針對CUT&RUN低產(chǎn)量和小片段規(guī)格的優(yōu)化參數(shù)，條形碼引物用于實(shí)現(xiàn)多路測序。EpiCypher的Library Prep Kit經(jīng)過專門優(yōu)化，可以進(jìn)一步簡化您的工作流程。

在測序之前，確認(rèn)CUT&RUN成功的最佳方法是對純化文庫進(jìn)行片段大小分布的分析。使用毛細(xì)管電泳（例如Agilent Bioanalyzer或TapeStation）確認(rèn)CUT&RUN文庫的片段大小分布和濃度。由于MNase將片段消化到核小體水平的分辨率，所以平均峰值一般約為~300?bp（~170?bp的片段DNA+adapter）。有關(guān)確保測序文庫質(zhì)量的更多詳細(xì)信息，請參閱該文。

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步驟8：Illumina?下一代測序

文庫以等摩爾比例匯集，并加載到所需的平臺(tái)上進(jìn)行測序。每個(gè)樣本只需要300-800萬次讀取，就可以獲得背景上的穩(wěn)健信號（相比之下，ChIP-seq則需要超過2000萬次讀取），并且允許用戶在單次運(yùn)行中多路傳輸10-100個(gè)樣本。

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本文中所描述的技術(shù)為EpiCypher公司所屬，均具有一項(xiàng)或多項(xiàng)專利。EpiCypher的注冊商標(biāo)和知識產(chǎn)權(quán)可見https://www.epicypher.com/intellectual-property/。本文中的所有其他商標(biāo)和商品均為其各自公司所有。

本文翻譯自鏈接https://support.epicypher.com/article/19-basic-steps-of-cut-run，如與原文有出入的地方，請以英文原文為準(zhǔn)。

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關(guān)于EpiCypher公司：

EpiCypher是一家成立于2012年的表觀遺傳學(xué)公司。從專有組蛋白肽陣列平臺(tái)EpiGold?開始，EpiCypher開發(fā)了一系列同類產(chǎn)品。同時(shí)，EpiCypher是重組核小體制造和開發(fā)的全球領(lǐng)導(dǎo)者。利用其獨(dú)有技術(shù)，不斷添加高純度修飾重組核小體（dNucs?）產(chǎn)品。dNuc?多樣性的產(chǎn)品為破譯組蛋白編碼和加速藥物開發(fā)提供了強(qiáng)大的工具。

EpiCypher還將dNuc?技術(shù)廣泛的應(yīng)用于多種分析測定產(chǎn)品中，包括：SNAP-ChIP?Spike-in Controls（用于抗體分析和ChIP定量）， EpiDyne?底物（用于染色質(zhì)重塑和抑制劑篩選及開發(fā)），dCyher?測定（用于探究表觀遺傳蛋白質(zhì)-組蛋白PTM結(jié)合相互作用）。最近，EpiCypher還推出了針對ChIC、CUT&RUN和CUT&Tag的高靈敏度表觀基因組圖譜CUTANA?分析。

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