Funakoshi品牌的FAOBlue是一款可通過(guò)熒光成像將活細(xì)胞內(nèi)脂肪酸β-氧化(FAO)活性可視化的試劑。只需將產(chǎn)品添加到培養(yǎng)基中,即可通過(guò)熒光觀察定量脂肪酸β-氧化活性。
FAO(脂肪酸β-氧化,F(xiàn)atty acid beta-oxidation)
脂肪酸(FA)是多種脂質(zhì)的基本成分,是細(xì)胞的重要組成部分,同時(shí)也是能量的主要來(lái)源之一。FA降解的主要途徑是通過(guò)線粒體脂肪酸β-氧化(FAO)。FAO 是肝臟、心臟和骨骼肌等器官能量平衡的關(guān)鍵代謝途徑。
FAO是一個(gè)復(fù)雜的生化過(guò)程,涉及多種酶的參與。FAO主要分為以下四個(gè)步驟:
1) 脫氫:脂酰-CoA 被?;鵆oA脫氫酶氧化成烯酰基-CoA;
2) 水合:烯酰-CoA-被烯酰-CoA水合酶合成-3-羥基乙酰-CoA;
3) 氧化:3-羥基乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為 3-酮酰-CoA;
4) 硫解:3-酮酰-CoA轉(zhuǎn)化為酰基-CoA(Cn-2)和乙酰-CoA。乙酰-CoA進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為ATP。生成的?;?CoA(Cn-2)進(jìn)入另一個(gè)FAO循環(huán),進(jìn)一步生成?;?CoA(Cn-4)。
研究表明,F(xiàn)AO代謝異常與肥胖和非酒精性脂肪肝?。∟AFLD)等多種疾病密切相關(guān),因此檢測(cè)FAO活性對(duì)于診斷相關(guān)疾病至關(guān)重要。但由于FAO過(guò)程較為復(fù)雜,使得在活細(xì)胞中檢測(cè)FAO活性的方法非常有限。目前只有一些間接方法,如使用含放射性同位素的脂肪酸或測(cè)量耗氧量。
FAOBlue作為首款直接測(cè)量活細(xì)胞中FAO活性的試劑,只需在培養(yǎng)基中加入FAOBlue,即可通過(guò)熒光成像,簡(jiǎn)單地檢測(cè)出活細(xì)胞中FAO的活性。
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FAOBlue原理
FAOBlue是一種具有被乙酰氧甲基酯保護(hù)的壬酸(C9)的香豆素染料。在被FAO代謝之前,F(xiàn)AOBlue在405 nm下不會(huì)激發(fā)熒光。FAOBlue的乙酰氧基甲酯可被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解,使FAOBlue可直接穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸(Free FA type);Free FA type會(huì)轉(zhuǎn)化為Acyl-CoA,并進(jìn)入FAO循環(huán);Acyl-CoA 經(jīng)過(guò)3次FAO循環(huán)分解為含有丙酸(C3)的非熒光香豆素。經(jīng)過(guò)第4次FAO循環(huán)后,香豆素染料從丙酸中釋放出來(lái)并擴(kuò)散到整個(gè)細(xì)胞。此時(shí)整個(gè)細(xì)胞內(nèi)的香豆素在405 nm下發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光,可視化地定量檢測(cè)細(xì)胞中FAO的活性。
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 分子式 | 分子量 | 溶解性 |
FDV-0033 | FAOBlue (Fatty Acid Oxidation Detection Reagent) | 0.2 mg | C24H31NO9 | 477.51 g/mol | 可溶于DMSO |
產(chǎn)品特點(diǎn)
操作簡(jiǎn)單,加入培養(yǎng)基后,孵育30-120min即可觀察熒光;
實(shí)例驗(yàn)證適用于多種細(xì)胞類(lèi)型。
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產(chǎn)品應(yīng)用
FAO活性的相對(duì)定量
評(píng)估藥物對(duì)FAO活性的影響
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實(shí)驗(yàn)步驟
1、在新鮮的HEPES緩沖液(HBS)中加入FAOBlue(最終濃度為5-20μM);
注:可用無(wú)血清培養(yǎng)基代替HBS
2、去除培養(yǎng)基,用HBS清洗細(xì)胞2次;
3、向細(xì)胞中加入含F(xiàn)AOBlue的HBS;
4、在37℃下培養(yǎng)30 min以上;
注:不同細(xì)胞類(lèi)型最佳培養(yǎng)時(shí)間有所不同,建議根據(jù)具體情況而定。
5、用HBS清洗細(xì)胞;
6、通過(guò)成像觀察活細(xì)胞中的藍(lán)色熒光(Ex. 405 nm/Em. 430~480 nm)。
成像指南
激光共聚焦顯微鏡:使用顯微鏡中配備的405 nm激光
落射熒光顯微鏡:激發(fā)濾光片非常重要,建議使用波長(zhǎng)為 390-450 nm的激發(fā)濾光片
應(yīng)用實(shí)例
一、FAOBlue及其香豆素衍生物的吸收光譜和熒光光譜
在PBS緩沖液(pH 7.4)中,F(xiàn)AO代謝后釋放的FAOBlue和香豆素衍生物的吸收光譜(左)、熒光光譜(右)。
FAOBlue經(jīng)過(guò)FAO轉(zhuǎn)化為香豆素衍生物后,吸收峰從FAOBlue發(fā)生偏移至405 nm。因此,在405 nm的激發(fā)條件下,F(xiàn)AOBlue不會(huì)發(fā)出熒光,只有在通過(guò)FAO釋放香豆素衍生物時(shí)才會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光。
注:FAOBlue在300-380 nm(最大350 nm)激發(fā)時(shí)顯示藍(lán)色熒光(灰色線,370-450 nm),所以在選擇濾光片時(shí)請(qǐng)格外注意,避免同時(shí)激發(fā)未反應(yīng)的FAOBlue以及FAO反應(yīng)后的香豆素衍生物。
二、各種癌細(xì)胞中FAO活性可視化
在4種癌細(xì)胞中加入FAOBlue,培養(yǎng)一定時(shí)間后進(jìn)行熒光觀察。所有細(xì)胞都出現(xiàn)藍(lán)色熒光,而經(jīng)過(guò)FAO抑制劑etomoxir處理后藍(lán)色熒光顯著減少。這些數(shù)據(jù)表明,藍(lán)色熒光是由活細(xì)胞中FAO活性引起的。(注:實(shí)驗(yàn)條件根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型不同而不同)
※HepG2 : 5 μM, 30 min、?LNCaP: 20 μM, 120 min、HeLa : 20 μM, 120 min、A549 : 5 μM, 30 min
三、藥物對(duì)FAO活性的干擾
對(duì)HepG2細(xì)胞分別進(jìn)行AICAR(通過(guò) AMPK 激活的 FAO 激活劑)和ranolazine(部分 FAO 抑制劑)處理,隨后加入FAOBlue(5uM)孵育30分鐘。結(jié)果顯示,與對(duì)照細(xì)胞(未處理)相比,AICAR處理后明顯增加藍(lán)色熒光強(qiáng)度,ranolazine處理后則明顯降低藍(lán)色熒光強(qiáng)度。
四、藥物對(duì)FAO活性影響的定量分析
將HepG2細(xì)胞與不同濃度的ND630預(yù)孵育4小時(shí)。ND630處理后,加入FAOBlue(5uM)孵育30分鐘。結(jié)果表明,伴隨ND630濃度增加,藍(lán)色熒光強(qiáng)度隨之增加。由此可知,ND630可增強(qiáng)FAO活性。(注:ND630是乙酰-CoA羧化酶抑制劑,被認(rèn)為是治療非酒精性脂肪肝(NAFLD)的潛在藥物)
五、NASH模型小鼠的FAO活性分析
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一種與脂質(zhì)相關(guān)的疾病,表現(xiàn)為脂肪酸代謝活性低。向正常小鼠和NASH模型小鼠以口服形式給藥增強(qiáng)脂質(zhì)代謝的bezafibrate后,提取原代肝細(xì)胞。向各組細(xì)胞加入FAOBlue(5 μM)觀察其FAO活性,結(jié)果顯示,相較正常小鼠來(lái)源細(xì)胞,NASH模型小鼠來(lái)源細(xì)胞的FAO活性明顯被抑制。另外,給藥bezafibrate的NASH模型小鼠來(lái)源細(xì)胞中FAO活性被恢復(fù)。
產(chǎn)品文獻(xiàn)
Uchinomiya et al., Chem. Commun., 56, 3023-3026 (2020) Fluorescence Detection of Metabolic Activity of Fatty Acid Beta Oxidation Activity in Living Cells.
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