很多科研的小伙伴在做免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí)，可能會(huì)遇到一些奇奇怪怪的問題，本篇小欣整理了免疫組化故障排除指南，大家可以根據(jù)下列的免疫組化故障排除指南來快速找出問題原因，改善您的實(shí)驗(yàn)步驟和解決方案。
首先可以從下面幾個(gè)情況中找到您的免疫熒光染色的問題所在：
一、染色較弱或無染色
可能存在的問題及解決方案：
一抗量不夠：
增加抗體濃度
延長(zhǎng)孵育時(shí)間
一抗二抗不兼容：
二抗應(yīng)該是抗一抗宿主的。例如，如果一抗是小鼠來源的，那就需要用抗小鼠的二抗
亞型需要兼容
待測(cè)組織干透：
在整個(gè)染色過程中都需要使樣品完全被覆蓋于溶液中。
細(xì)胞沒有通透：
用甲醇或者丙酮固定可以通透細(xì)胞
如果使用甲醛固定，用0.2% Triton X-100通透細(xì)胞
脫蠟不充分：
加長(zhǎng)切片脫蠟時(shí)間
確保使用新鮮配制的二甲苯
一抗不適用：
確?？贵w被驗(yàn)證過適用于對(duì)應(yīng)類型的IHC, 福爾馬林固定, 石蠟包埋, 新鮮凍存切片等等。
? 使用WB先檢測(cè)抗體，確?？贵w沒有變質(zhì)。
組織過度固定：
減少固定的時(shí)間
做抗原修復(fù)以顯現(xiàn)抗原表位
孵育時(shí)間太短：
增加一抗和樣品孵育的時(shí)間
切片儲(chǔ)存問題：
樣品染色后應(yīng)該盡快觀察，否則信號(hào)會(huì)隨時(shí)間減弱。如需要的話，將切片保存在 4?C 黑暗處。
抗體儲(chǔ)存問題：
反復(fù)凍融是對(duì)抗體不利的，可引起降解. 最好是在收到產(chǎn)品時(shí)將其分成多個(gè)小份來保存。
抗體沒有按照建議的方式保存. 如果是這樣的話可能需要重新購買一支。
如果二抗沒有在黑暗處保存 (使用免疫熒光時(shí)), 應(yīng)更換一支新的二抗。
蛋白沒有在檢測(cè)的組織中出現(xiàn)：
做一個(gè)陽性對(duì)照
如果目標(biāo)蛋白顯現(xiàn)但是信號(hào)不強(qiáng), 增加一個(gè)擴(kuò)大信號(hào)步驟
二、高背景染色
可能存在的問題及解決方案：
脫蠟不充分：
加長(zhǎng)切片脫蠟時(shí)間
確保使用新制的二甲苯
內(nèi)源的過氧化物酶活性：
如果使用的是HRP檢測(cè)系統(tǒng)，在進(jìn)行染色步驟前用3% H2O2 降低內(nèi)源過氧化物酶活性
內(nèi)源的生物素：
如果使用的是生物素檢測(cè)系統(tǒng)，而樣品中內(nèi)源生物素水平又很高 (例如. 腎臟，肝臟，胰臟)，那么需要先使用抗生物素蛋白孵育樣品來封閉內(nèi)源生物素，再進(jìn)行正常的封閉步驟，然后在一抗孵育前再用生物素封閉。
抗體濃度太高：
進(jìn)一步稀釋一抗/二抗
非特異性結(jié)合：
做一個(gè)沒有一抗的二抗空白對(duì)照.? 如果有染色，說明二抗有非特異性結(jié)合，更換一種二抗，或者使用標(biāo)記一抗
封閉不充分：
增加封閉孵育時(shí)間或考慮更換封閉液。
信號(hào)放大過度：
減少信號(hào)放大孵育時(shí)間，稀釋二抗
洗滌不充分：
步驟之間的適當(dāng)洗滌非常重要. 確保遵循說明說上的洗滌步驟
組織切片太厚：
考慮使用更薄的切片，因?yàn)檫^厚的切片超過了共焦平面的部分會(huì)造成過度的背景染色
三、非特異性染色
抗體濃度過高：
降低抗體的濃度和孵育時(shí)間
一抗宿主與要染色的組織來源是同一物種 (例. 小鼠抗小鼠的一抗):
? 嘗試使用來自不同物種的一抗?；蛘邍L試用二抗宿主的血清來阻斷內(nèi)源的IgG ?；蛘哂?1% Triton 孵育切片以清理組織?；蛘呤褂?TBS-Tween 20作為洗滌液而不是用 PBS-Tween 20。
如以上內(nèi)容未能解決您的需求，可聯(lián)系我們欣博盛生物相關(guān)技術(shù)同事，幫您解疑答惑。
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