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免疫熒光實(shí)驗(yàn)操作指南

2021-12-02
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該免疫熒光實(shí)驗(yàn)方法僅供參考,由于每個(gè)實(shí)驗(yàn)使用的試劑不同,并且涉及不同的物種,組織類型及實(shí)驗(yàn)應(yīng)用,實(shí)驗(yàn)人員設(shè)計(jì)應(yīng)根據(jù)具體情況設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟和改良。


-切片制備


A. 細(xì)胞涂片


將培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)于無(wú)菌的蓋玻片或載破片上,37℃過(guò)夜孵育。


用PBS簡(jiǎn)單洗滌。


按需固定. 可用的步驟有:


含10% 福爾馬林的PBS 固定10分鐘 (保持濕潤(rùn)).


冰冷的甲醇固定5分鐘,自然干燥。


冰冷的丙酮固定5分鐘,自然干燥。


用PBS沖洗。


B. 冷凍組織切片


在液氮或用液氮預(yù)冷的異戊烷中切割冷凍的新鮮組織, 放置于含有OCT凍存液的cryomolds被膜中. 速凍后保存在 – 80 ?C。


用恒冷箱切片機(jī)將組織切成4-8 um 厚的切片,然后固定在急凍切片或明膠包被過(guò)的切片。使用前將切片保存于 – 80℃。


染色之前,將切片置于室溫下 30分鐘然后于冰冷的丙酮中固定5分鐘。自然干燥30分鐘。


在PBS中漂洗。


C. 石蠟組織切片


將切片在二甲苯中去石蠟兩次,每次5min.


使用100% 乙醇水化兩次,每次3min.


使用95%乙醇水化 1min.


蒸餾水漂洗.


按需根據(jù)預(yù)制備步驟操作.


-組織切片預(yù)制備


*對(duì)于非石蠟包埋的冷凍切片和培養(yǎng)細(xì)胞,請(qǐng)不要使用該預(yù)制備步驟。


被福爾馬林固定和石蠟包埋封閉的抗原決定簇可以使用抗原修復(fù)劑、酶消化或肥皂精等來(lái)使之顯示。


-步驟


在PBS-Tween 20 中漂洗切片兩次,每次2分鐘。


血清封閉: 用正常血清封閉孵育切片 – 物種來(lái)源應(yīng)與二抗相同, 孵育30分鐘來(lái)封閉非特異的免疫球蛋白結(jié)合。 注意:由于該實(shí)驗(yàn)使用的 avidin-biotin 檢測(cè)系統(tǒng), 根據(jù)組織類型不同,可能需要avidin/biotin 封閉,avidin/biotin 封閉應(yīng)在正常血清封閉之后。


一抗: 在一抗溶液中孵育切片,室溫下1小時(shí)或4℃過(guò)夜。


在PBS-Tween 20中漂洗。


二抗: 在生物素化二抗溶液中孵育切片,室溫下30分鐘。


用PBS-Tween 20 漂洗三次,每次2分鐘。


檢測(cè): 在含F(xiàn)ITC-Avidin D 的PBS溶液中孵育切片,室溫下30分鐘。從該步驟開(kāi)始要確保切片避光,直到最后將切片用鋁箔紙包裹或放進(jìn)避光盒子中。


用PBS-Tween 20 漂洗三次,每次2分鐘。


如需要,用PI 或 DAPI 復(fù)染色。


在PBS-Tween 20中漂洗。


用95% 乙醇脫水 2 分鐘, 100% 乙醇脫水兩次,每次3分鐘。


用抗褪色固定介質(zhì)覆蓋切片。



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