該實(shí)驗(yàn)操作指南是將1 型小鼠PFFs (SPR-324) 或1 型人PFFs (SPR-322) 注射到大鼠腦中來(lái)產(chǎn)生alpha突觸核蛋白病理特征。小鼠PFFs顯示出了更強(qiáng)的聚集效果。
使用的動(dòng)物: 雌性SD (Sprague Dawley) 大鼠
2 uL PFFs 或者單體 (陰性對(duì)照) 通過(guò)以下兩個(gè)腦頂葉區(qū)的位置注射:
?AP + 1.6, ML + 2.4, DV – 4.2
?AP – 1.4, ML + 0.2, DV – 2.8
30天后, 用生理鹽水灌注大鼠然后在大鼠腦冠狀平面切開，將中腦與前腦分開。之后兩部分都用4% PFA 固定 48 小時(shí).
DAB 操作步驟
材料
?1X TBS (含有和不含有 TX-100的)
?30% H2O2
?檸檬酸緩沖液
?驢血清 (保存在 -20℃; 凍融穩(wěn)定的)
?一抗: pSYN EP1536Y (Abcam; ab51253)
?二抗: 生物素-SP (long spacer) AffiniPure 驢抗兔 IgG (H+L) (Jackson Immuno; 貨號(hào): 711-065-152)
?ABC 試劑 (Vector; 貨號(hào): PK-7100)
?DAB 試劑 (Vector; 貨號(hào): SK-4100)
?孔板 (規(guī)格取決于要染色的區(qū)域數(shù)量)
?漆刷
?玻璃鉤
?漂白劑
?ddH20
?BD Luer-lock 注射器 10 mL
?過(guò)濾器 0.22 uM 孔徑 (Fisher 貨號(hào). SLMP025SS)
?100% EtOH
?Histoclear (用于清理組織)
?顯微鏡載玻片和蓋玻片
?Permount (封片劑)
?
第一天:? ? (猝滅, 抗原修復(fù), 阻斷, 一抗)
-用 1X TBS (震蕩, 室溫)沖洗切片 5 次以除去冷凍保護(hù)劑。
-把切片放到 0.6% H2O2 的 TBS 中，覆蓋好，置于操作臺(tái)20分鐘。
*該步驟不要用MESH WELLS*
用 _______ mL TBS, _______ uL 30% H2O2
-用 1X TBS (震蕩, 室溫) 沖洗切片3次。
-做抗原修復(fù)時(shí), 提前在水浴中預(yù)熱檸檬酸緩沖液至少15~30分鐘。在檸檬酸緩沖液中培養(yǎng)切片一小時(shí)，將溫度設(shè)置為37℃，不要震蕩 。
-用 1X TBS (震蕩, 室溫) 沖洗切片3次。
-阻斷時(shí), 將切片置于 5% 常規(guī)驢血清和0.25% Triton-100的TBS 中阻斷 1 小時(shí)，冷室、震蕩。
*注意: 可以使用含有Triton的TBS阻斷液 (1 L TBS, 2.5 mL TX-100), 之后只需要向阻斷液中加入驢血清來(lái)阻斷。*
用 _______ mL TBS,
_______ uL 驢血清, _______ uL 10% TX-100
-用 1X TBS (震蕩, 室溫) 沖洗切片3次。
-用含 5% 驢血清的 TBS制備一抗溶液，稀釋度為1：5000。用錫紙包好切片，和抗體一起在冷室中震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
用 _______ mL TBS,
_______? uL 驢血清, _______ uL pSYN EP1536Y
第二天:? ? (二抗, ABC 擴(kuò)大信號(hào), DAB 染色)
-用 1X TBST (震蕩，室溫) 沖洗切片3次. 余下的步驟中，需要一直將切片保留在錫紙里，即使是沖洗的步驟。
-用含 5% 驢血清的 TBS 制備二抗溶液，稀釋度為1：500。在冷室中培錫紙養(yǎng)蓋好的切片2小時(shí)，震蕩。
用 ______mL TBS,
?______ uL 驢血清, _______ uL 生物素標(biāo)記的驢抗兔 IgG
-用 1X TBST (震蕩，室溫) 沖洗切片3次。
-用 ABC 試劑培養(yǎng)切片 30 分鐘 (震蕩, 冷室)。
-用 1X TBS 沖洗切片 3 次 (震蕩，室溫)。
-用 falcon 離心管和 ddH2O制備 DAB 溶液，每 5 mL H2O 加入如下溶液然后渦旋混合:
2 滴緩沖溶液
4 滴 DAB 溶液
2 滴雙氧水溶液
*注意: 所有接觸過(guò)DAB的器具只能用來(lái)操作DAB。我們還在通風(fēng)櫥內(nèi)準(zhǔn)備了一個(gè)DAB專用的廢液缸。使用玻璃鉤來(lái)處理DAB溶液中的切片而不能用漆刷，并且操作后要用漂白劑沖洗玻璃鉤。盛裝過(guò)DAB的器皿都需要用漂白劑沖洗并且處理到生物性危害箱中。*
-用注射器過(guò)濾到新的6孔板中。每一個(gè)需要染色的腦切片都用一個(gè)新的DAB孔。
-在DAB中培養(yǎng)每個(gè)切片直到變?yōu)闇\棕色 (2-3 分鐘就足夠; 時(shí)間太長(zhǎng)可能會(huì)造成背景染色太多)
-用 ddH2O 沖洗 3 次
-在 1X TBS 中封片，然后在切片柜中干燥過(guò)夜。
第三天:? ? (脫水和蓋玻片)
*注意: 在開始脫水步驟之前，確保浸片用的玻璃皿里有足夠的液體可以蓋過(guò)切片上的所有組織。*
-按照如下順序和時(shí)間脫水切片：
1. 30 秒 ddH20
2. 3 分鐘 70% EtOH
3. 3 分鐘 95% EtOH
4. 3 分鐘 95% EtOH
5. 3 分鐘 100% EtOH
6. 3 分鐘 100% EtOH
*置于振蕩器*
7. 5 分鐘 Histoclear
8. 5 分鐘 Histoclear
9. 5 分鐘 Histoclear
-將切片從切片籃從取出，一次一片，置于吸水紙上。
-加封片劑時(shí)，取一個(gè)P1000 移液器和吸頭，將吸頭尖剪掉，容量設(shè)到400到500 μL.
-連續(xù)滴幾滴封片劑 Permount 到切片的中間，傾斜切片使封片劑完全覆蓋切片。
-用棉棒的木頭一端趕出切片中的氣泡。
-將切片放在吸水紙上，置于操作臺(tái)上過(guò)夜晾干。
*注意: ~24 小時(shí)之后, 多余的Permount 封片劑應(yīng)該用Histoclear移除*
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