表面抗原密度
細(xì)胞攜帶的抗原或靶分子的數(shù)量與陽性群的強(qiáng)度直接相關(guān), 并將決定與其匹配的最佳熒光素。
將熒光強(qiáng)度低的熒光素與高表達(dá)抗原配對(duì), 將熒光強(qiáng)度強(qiáng)高的熒光素與低豐度抗原配對(duì), 可以提高細(xì)胞群體的分辨率, 但是如何得知抗原密度呢？
本指南列出了一些常見的人和小鼠細(xì)胞表面標(biāo)記物的抗原密度, 以幫助您選擇正確的熒光素。另外提供了如何使用抗體結(jié)合珠測(cè)量抗原密度的方法。
常見人標(biāo)記物的抗原密度
新鮮分離的外周血細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的常見標(biāo)記物的抗原密度。
圖 1.21 種常見人類標(biāo)記的數(shù)據(jù)。獲得每個(gè)表面標(biāo)記物的幾何平均熒光強(qiáng)度，并將其轉(zhuǎn)換為抗原密度, 并以對(duì)數(shù)刻度繪制。圖中結(jié)果來自于正常人外周血的 4 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在 Bio-Rad ZE5 流式細(xì)胞分析儀上獲取數(shù)據(jù)并在 FlowJo 中進(jìn)行結(jié)果分析。
熒光素亮度
本示例說明了 CD4 與更亮熒光素（PE）配對(duì)可以提高分辨率。
圖 2. 熒光素的相對(duì)亮度。外周血 CD4 染色的示例顯示了 3 種熒光團(tuán)從暗（Pacific Blue）到亮（PE）的相對(duì)亮度。顯示的數(shù)據(jù)是在 Bio-Rad ZE5 流式細(xì)胞分析儀上獲得的。
常見小鼠標(biāo)記物的抗原密度
C57BL/6 小鼠的新鮮分離的脾臟細(xì)胞表面的常見標(biāo)記物的抗原密度。
圖 3.16 種常見小鼠標(biāo)記物的數(shù)據(jù)。獲得每個(gè)表面標(biāo)記物的幾何平均熒光強(qiáng)度, 并將其轉(zhuǎn)換為抗原密度, 并以對(duì)數(shù)刻度繪制。圖中數(shù)據(jù)來自于 C57Bl/6 小鼠的 3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在 Bio-Rad ZE5 流式細(xì)胞分析儀上獲取數(shù)據(jù)并在 FlowJo 中進(jìn)行結(jié)果分析。
熒光素配對(duì)
為了獲得最佳結(jié)果, 應(yīng)將低密度抗原與明亮的熒光素配對(duì), 將高密度抗原與較暗的熒光素配對(duì)。
圖 4. 染色示例。 A, 人外周血單核細(xì)胞用 CD14 A700 和 CD163 A488 染色。B, 小鼠骨髓細(xì)胞用CD11b PB 和 GR-1 FITC 染色。在 Bio-Rad ZE5 流式細(xì)胞分析儀上獲取數(shù)據(jù)。
| 星光染料分類 | 已上市和待上市染料 |
| StarBright Blue? （488 nm） | SBB510,SBB575, SBB610,SBB670, SBB700,SBB750, SBB780 |
| StarBright Violet? （405 nm） | SBV440,SBV475, SBV515,SBV570, SBV610,SBV670, SBV710,SBV760, SBV790 |
StarBright UV （355 nm） | SBUV400,SBUV445, SBUV510,SBUV575,? SBUV605,SBUV665,? ?SBUV750,SBUV795 |
全新流式染料星光系列：更亮的亮度, 更窄的發(fā)射波普, 緩沖液兼容性好, 染色一致性好（具體見上表）。
四個(gè)簡(jiǎn)單步驟測(cè)量抗原密度
Quantum 系列校準(zhǔn)微球有 FITC 和 PE 兩種熒光標(biāo)記可選根據(jù)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)抗體的熒光素來選擇, 微球大小近似于人類淋巴細(xì)胞, 中級(jí)強(qiáng)度的試劑盒可以很好地涵蓋典型細(xì)胞樣品的范圍。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線, 可以計(jì)算待檢測(cè)抗原的密度。該種方法也可用于確定流式細(xì)胞儀線性度。
1、滴定抗體
通過合適的抗體濃度找到最佳的染色指數(shù)。
2、微球染色
確保微球的量是飽和的。珠子的熒光強(qiáng)度隨著抗體結(jié)合能力 ( ABC ) 而增強(qiáng)。
3、創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線
使用半高/全寬門測(cè)量幾何平均值, 創(chuàng)建針對(duì)抗體結(jié)合能力的熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4、測(cè)量抗原密度
使用陽性群體的幾何平均熒光強(qiáng)度, 可以計(jì)算感興趣細(xì)胞上任何抗原的密度。
Bio-Rad 于 2013 年 1 月收購了知名抗體公司 AbD Serotec。該公司成立于 1982 年, 總部位于英國牛津。提供上萬種抗體和免疫學(xué)試劑、單抗制備和多種規(guī)模的抗體生產(chǎn)和標(biāo)記服務(wù)。其宗旨為生產(chǎn)高質(zhì)量的抗體和免疫學(xué)試劑。該公司擁有最具特色的大鼠 CD68 單抗（克隆號(hào): ED1）; 抑制素 A 檢測(cè)試劑盒為專利產(chǎn)品; 將 SpyTag 技術(shù)引入 HuCAL 平臺(tái), 提供非動(dòng)物來源的抗體定制服務(wù)。
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