1、天然Tregs和誘導(dǎo)性Tregs的區(qū)別是什么？
天然T細(xì)胞來源于胸腺CD4+細(xì)胞中高表達(dá)CD25并表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的細(xì)胞，不受環(huán)境中細(xì)胞因子的影響(屬于細(xì)胞因子非依賴型）。天然Tregs大約占CD4+細(xì)胞5-10% 可以在T淋巴細(xì)胞發(fā)育的單陽性階段首先出現(xiàn)，并由于具有與自身抗原的高親和力而被陽性選擇。此信號傳遞是通過T細(xì)胞受體和胸腺基質(zhì)細(xì)胞上的帶有自身抗原膚的MHC 復(fù)合體相互作用完成。
另一方面，誘導(dǎo)性Tregs (iTregs) 來源于胸腺CD4單陽性細(xì)胞，當(dāng)有足夠的同源抗原刺激或者特異性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如TGF-β，IL-10 and IL-4存在時，可以分化成CD25+，并表達(dá)FoxP3 的Tregs一 因此稱為“適應(yīng)性”或“誘導(dǎo)性”Tregs。 根據(jù)調(diào)節(jié)因子的不同，適應(yīng)性或誘導(dǎo)性Tregs又被進(jìn)一步分為Tr1，Tr2，或Tr3細(xì)胞。
2、小鼠和人CD4+Tregs有區(qū)別嗎？
有的。在小鼠中，CD4+Tregs是一組同源性細(xì)胞群，所有的CD4+及CD25+細(xì)胞均為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。人類的Tregs是異質(zhì)性細(xì)胞群，并不是所有的CD25+細(xì)胞都是Tregs。這一研究最早是由哈佛大學(xué)、the Royal Free and University College Medical School的科研人員通過對人CD4+CD25+細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)分析時觀察到的。
研究結(jié)果顯示，只有體外高表達(dá)CD25 (約占總CD4 T細(xì)胞2-3%) 的CD4+T細(xì)胞在體外才有抑制活性，這是相對與把表達(dá)CD25的細(xì)胞都當(dāng)做Tregs的小鼠細(xì)胞而言，而且表達(dá)低到中等水平CD25的細(xì)胞在體外沒有抑制活性。
3、Tregs在CD4+細(xì)胞中的比例是多少？ 此比例是否隨著人年齡的增長而發(fā)生改變？
此數(shù)據(jù)也是4-9% (未經(jīng)發(fā)表的內(nèi)部統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù))。然而即使在健康的捐贈者中，此數(shù)據(jù)也會有一定程度的改變。CD4+CD127loCD25+ Tregs的平均百分比在人的一生中只會發(fā)生輕微的增長（在人成年之后的20歲到25歲期間，其比例會從臍帶血的6.10%增加到PBMCs的7.22%；到人類60歲時，PBMCs中的比例會達(dá)到7.5%）。研究顯示，在健康的人及小鼠，CD4+/CD25+Tregs比值都會隨著年齡的增加發(fā)生輕度增長。然而增長的Tregs數(shù)量與棉衣衰老質(zhì)檢確切的聯(lián)系尚不明確
4、為什么把CD127作為人Tregs的標(biāo)志至關(guān)重要？
來自Barbara Fazekas de St. Groth (Centenary Institute of Cancer Medicine and Cell Biotogy, Sydney, Australia) and Jeffrey Bluestone (UCSF Diabetes Center,San Francisco,CA)實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)顯示低表達(dá)CD127可以區(qū)別鑒定人Tregs。其低表達(dá)與FoxP3密切相關(guān)，并且顯示CD127loCD25int/hi的CD4+T淋巴細(xì)胞就是Tregs。CD127low優(yōu)于胞內(nèi)表達(dá)的FoxP3的地方在于檢測時不需要固定和破膜，細(xì)胞仍然存活，所以隨后可用于培養(yǎng)或其他的體外實(shí)驗(yàn)。當(dāng)用CD25的高表達(dá)判定Tregs時，研究人員可從正常的細(xì)胞群體中獲得0.6%-7.9%的Tregs。而用CD127的低表達(dá) (結(jié)合CD25) 作為新的圈門標(biāo)準(zhǔn)通常會得到單獨(dú)用CD25high圈門而丟失的細(xì)胞。 此方法分選的CD25int/high Treg細(xì)胞比單獨(dú)用CD25high圈門方式分選的Treg細(xì)胞的回收率增加了2-4倍，而且減少了CD25-/int效應(yīng)細(xì)胞的污染。
5、哪些表面標(biāo)志可分別用來鑒定人及小鼠CD4+T細(xì)胞？
目前推薦的判定人CD4 Tregs細(xì)胞的表面標(biāo)志包括GITR，CTLA4 (細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白) ，CD39，CD62L，CDl27，CDl03以及結(jié)合CD45RA+表達(dá)的 LAG3(淋巴細(xì)胞活化基因 ) 。在小鼠中，F(xiàn)R4hiCD25+為n Tregs，F(xiàn)RloCD25+為效應(yīng)T細(xì)胞，F(xiàn)R4hiCD25-為記憶T細(xì)胞，CD2S-CD4+為初始T細(xì)胞 。
6、什么是Foxp3？如何與CD4+T調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相結(jié)合？
Foxp3 ((forkhead box P3) 是種胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，是Tregs的特異性標(biāo)志。在小鼠淋巴細(xì)胞增生性疾病的研究中被發(fā)現(xiàn)，而且在小鼠自發(fā)性基因突變“scurfy ”中可被檢測到。在人類，由于FoxP3基因缺失可導(dǎo)致IPEX，所以Foxp3可有助于惡性自身免疫病IPEX (immunedysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked)的研究。
7、除了CD4細(xì)胞，是否還有其他類型的細(xì)胞也可表達(dá)Foxp3？
是的。有研究顯示CD8細(xì)胞也可表達(dá)FoxP3，而且天然狀態(tài)下也具有調(diào)節(jié)功能 。
8、人Foxp3是否存在多種異構(gòu)體？BD Biosciences Foxp3 clone 259D/C7可識別哪種異構(gòu)體？
有的。Foxp3有兩種異構(gòu)體：全長形式和缺乏外顯子2的剪接變體。CD4+/CD25+細(xì)胞均可表達(dá)這兩種異構(gòu)體。
9、做抗人的Foxp3染色之前，樣本可保存多久？
樣本染色之前，-80℃保存人的PBMCs于人FoxP3緩沖液中24-72小時都是可行的。
10、小鼠Foxp3抗體可用于人Foxp3緩沖液嗎？反過來是否可行？
不行。我們不建議互換人與小鼠的Foxp3緩沖液體系。要想得到小鼠或人FoxP3克隆最好的染色結(jié)果，我們建議參照不同克隆推薦的最適緩沖體系進(jìn)行試驗(yàn)。
11、Foxp3染色是否可應(yīng)用于人全血細(xì)胞樣本？
可以。選擇pBMCs作為高速細(xì)胞計(jì)數(shù)樣本的首要原因，就是需要溶解/固定/破膜大量的全血以得到實(shí)驗(yàn)所需的足夠的細(xì)胞數(shù)量。例如1ml全血含有大約1x10^6個淋巴細(xì)胞，而只有少于4-9%的CD4+細(xì)胞是Tregs。
12、如何檢測Tregs功能？
Tregs可根據(jù)其對靶細(xì)胞功能的抑制能力進(jìn)行檢測，例如：
抑制靶細(xì)胞增殖或者
抑制靶細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌
抑制標(biāo)志物的活化
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