產(chǎn)品名稱：Human TGF-β1 ELISA kit
中文名：人TGF-β1 ELISA試劑盒
貨號：EHC107b
檢測原理:
欣博盛 QuantiCyto? ELISA試劑盒采用雙抗體夾心法：抗人TGF-β1單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的人TGF-β1會與單抗結(jié)合，游離的成分被洗去。加入生物素化的抗人TGF-β1抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，生物素與親和素特異性結(jié)合；抗人TGF-β1抗體與結(jié)合在單抗上的人TGF-β1結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應(yīng)孔中有人TGF-β1，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑現(xiàn)藍色，加終止液變黃。在450 nm處測OD值，人TGF-β1濃度與OD450值之間呈正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中人TGF-β1的濃度。
試劑盒組成：
儲存條件：
試驗所需自備試驗器材 (不提供，但可協(xié)助購買) :
1. 酶標(biāo)儀(450 nm波長濾光片)
2. 進口品牌高精度加液器及一次性吸頭：0.5-10 ul, 2-20 ul, 20-200ul, 200-1000 ul。
3. 37 ℃恒溫箱, 雙蒸水或去離子水，坐標(biāo)紙等。
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標(biāo)本收集:
1. 收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。
2. 血漿抗凝劑推薦使用EDTA。避免使用溶血，高血脂標(biāo)本。
3. 標(biāo)本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。
4. 標(biāo)本收集后若不及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20 ℃，-70 ℃電冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融，3-6月內(nèi)檢測。
5. 如果您的樣本中檢測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請根據(jù)實際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議做預(yù)實驗，以確定稀釋倍數(shù))。
?注意事項:
1. 試劑盒使用前請保存在2-8 ℃。復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品若未用完，請廢棄。
2. 濃縮生物素化抗體，濃縮酶結(jié)合物體積小，運輸中顛簸和可能的倒置，會使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。
3. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,屬于正?，F(xiàn)象，微加熱至40℃使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液。（加熱溫度不要超過50 ℃）使用時洗滌液應(yīng)為室溫。
4. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應(yīng)終止液除外）。請?zhí)崆白稍冃啦┦⑸锟萍加邢薰尽?/p>
5. 充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用最低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。
6. 在試驗中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測時建議作雙孔檢測。
7. 試驗中所用的試管和吸頭均為一次性使用，嚴(yán)禁在不同的液體之間混用！否則將影響試驗結(jié)果。
8. 試驗中請穿著試驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液標(biāo)本時，請按國家生物試驗室安全防護條列執(zhí)行。
9. 如果分次使用，請根據(jù)需要量配制各組分，以免配制過多造成浪費而影響后續(xù)試驗。剩余板孔請用封板膠紙封住，放回鋁箔袋中,2個月內(nèi)用完。
檢測前準(zhǔn)備工作:
1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。
2. 用雙蒸水將20×濃縮洗滌液稀釋成1×工作液。未用完的放回4 ℃。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 加入標(biāo)準(zhǔn)品&標(biāo)本通用稀釋液1.0ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為2000 pg/ml)。然后根據(jù)需要進行稀釋。(建議標(biāo)準(zhǔn)曲線使用以下濃度：2000、1000、
500、250、125、62.5、31.25、0 pg/ml)。0 pg/ml即空白孔。復(fù)溶標(biāo)準(zhǔn)品原液(2000 pg/ml）若未用完的請廢棄。
4. 生物素化抗體工作液：按當(dāng)次試驗所需要得用量，使用前20分鐘，用生物素化抗體稀釋液將30×濃縮生物素化抗體稀釋成1×工作液。當(dāng)日使用。若實驗次數(shù)過多導(dǎo)致生物素化抗體量不足，可向欣博盛公司單獨購買生物素化抗體。（須提供抗體批號）
5. 酶結(jié)合物工作液：按當(dāng)次試驗所需要的用量，使用前20分鐘，用酶結(jié)合物稀釋液將30×濃縮酶結(jié)合物稀釋成1×工作液。當(dāng)日使用。若實驗次數(shù)過多導(dǎo)致濃縮酶結(jié)合物量不足，可向欣博盛公司單獨購買濃縮酶結(jié)合物。（須提供酶結(jié)合物批號）
6. 標(biāo)本預(yù)處理：
血清或血漿標(biāo)本激活方法:
a.在225ul標(biāo)準(zhǔn)品&標(biāo)本通用稀釋液中，加入5μl血清或血漿標(biāo)本。
b.加10ul A液(激活液),蓋緊，上下混勻。2－8℃放置60?2分鐘。
c.加10ul B液(終止液),蓋緊，上下混勻。(總體積250ul即50倍稀釋)
d.即用，或置-20/-70℃可保存3天。計算結(jié)果時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
(注意：不同的標(biāo)本TGF-β1的水平可能有較大差異,請根據(jù)實際情況
靈活掌握稀釋度，不同濃度稀釋僅需要改變稀釋液體積)
細胞培養(yǎng)上清標(biāo)本激活方法:
a.在80ul標(biāo)準(zhǔn)品&標(biāo)本通用稀釋液中，加入100μl標(biāo)本。
b.加10ul A液(激活液),蓋緊，上下混勻。2－8℃放置60?2分鐘.?
c.加10ul B液(終止液), 蓋緊，上下混勻。(總體積200ul即2倍稀釋)。
d.即用，或置-20/-70℃可保存3天。計算結(jié)果時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。. (注意：不同的標(biāo)本TGF-β1的水平可能有較大差異，請根據(jù)實際情況靈活掌握稀釋度，不同濃度稀釋僅需要改變稀釋液體積)
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例：
以500 ul/管為例，用標(biāo)準(zhǔn)品&標(biāo)本通用稀釋液將復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品母液進行倍比稀釋，具體稀釋方法如下圖，也可根據(jù)實際用量來稀釋，如200 ul/管。
洗滌方法:
1. 自動洗板機：要求注入的洗滌液為350 ul，注入與吸出間隔30－60秒。洗板5次。
2. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350 ul，靜置30秒后甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干。洗板5次。?
操作步驟:
1．從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和干
燥劑請放回鋁箔袋內(nèi)壓實自封條，密封口袋，放回4 ℃。
2．空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品&標(biāo)本通用稀釋液，其余相應(yīng)孔中加標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100 ul/孔)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育90分鐘。
3．提前20分鐘準(zhǔn)備生物素化抗體工作液。
4．洗板5次。
5．空白孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液(100 ul/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育60分鐘。
6．提前20分鐘準(zhǔn)備酶結(jié)合物工作液。避光室溫(22-25 ℃)放置。
7．洗板5次。
8．空白孔加酶結(jié)合物稀釋液，其余孔加入酶結(jié)合物工作液(100 ul/
孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育30分鐘。
9．打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測程序。
10．洗板5次。
11．加入顯色底物(TMB)100 ul/孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育15分鐘。
12．加入反應(yīng)終止液100 ul/孔, 混勻后即刻測量OD450值(3分鐘內(nèi))。
在儀器保存讀數(shù)結(jié)果并打印一份紙質(zhì)結(jié)果。
13. 實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回電冰箱保存至有效期結(jié)束。
建議保存酶標(biāo)板框，以備下次或者今后試驗使用。
結(jié)果判斷:
1. 每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去空白孔的OD值。
2. 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，手工繪制或用軟件繪制并選取最佳擬合曲線，推薦使用二次多項式方程擬合。通過標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。
3. 若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計算濃度時
應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計算標(biāo)本中人TGF-β1的含量。
靈敏度、特異性和重復(fù)性:
● 靈敏度：最小可測人TGF-β1達15.6 pg/ml。
● 特異性：不與重組人acivin A,Activin RIA,BMP-2,BMP-3,BMP-3b, BMP-4,BMP-5，BMP-6，BMP-8b，BMP-10，BMP-15，BMPR-IA
等反應(yīng)。
● 重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10%。
人 TGF-β1 簡介：
TGF-β1 (Transforming growth factor-β1)是一類在結(jié)構(gòu)和功能上具有某些特點的多肽 因子家族。該家族包括同二聚體從 TGF-β1 至TGF－β5，異二聚體有 TGF-β1，2。TGF-β1 以非活性狀態(tài)存在，激活時是 TGF-β1 活性部分的釋放。在體外，TGF-β1 的活化是對其酸化。TGF-β1 具有激活和抑制雙重功能。許多 TGF-β1 的受體調(diào)節(jié)其生 物 活 性 ， 有 受 體 I(53-65KD) ， 受 體 II(83-110KD) ， 受 體III(250-310KD), 受體 IV(60KD), 受體 V(400KD)。TGF-β1 是一種多功能細胞生長調(diào)節(jié)蛋白，TGF-β最初由血小板中分離出來，后發(fā)現(xiàn)在許多組織中均可表達。TGF-β是多肽家族成員，包括 5 種形式(1～5)。
TGF-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)和激動劑 A(activin A)有相近的分子結(jié)構(gòu)，因此它們有可能由同一原始基因演變而來。TGF-β刺激未轉(zhuǎn)化成骨細胞 (untransformed osteoblastic cell)DNA 的合成和細胞的增殖，其對成骨細胞分化功能的作用也因細胞處于不同的分化階段而不同。有研究表明，TGF-β對骨吸收有雙重作用--既抑制又促進。它參與了胚胎的發(fā)育、損傷組織的修復(fù)、腫瘤的發(fā)生和發(fā)展等生理病理過程，是目前眾多學(xué)科的研究熱點。
部分文獻引用：
Xie Y, W. H., Mao J, et al. (2019). Enhanced in vitro Efficacy for Inhibiting Hypertrophic Scar by Bleomycin-loaded Dissolving Hyaluronic Acid Microneedles. Journal of Materials Chemistry B.?
Sun S W, C. L., Zhou M, et al. (2019). BAMBI regulates macrophages inducing the differentiation of Treg through the TGF-β pathway in chronic obstructive pulmonary disease. Respiratory Research.?
Zhao J, X. B., Chen G, et al. (2019). Cryopreserved platelets augment the inflammatory response: role of phosphatidylserine-and P-selectin-mediated platelet phagocytosis in macrophages. Transfusion.?
Liu J, Z. B., Zhu H, et al. (2019). Wnt4 negatively regulates the TGF-β1-induced human dermal fibroblast-to-myofibroblast transition via targeting Smad3 and ERK. Cell and tissue research.?
Liu C, Q. L., Ding J, et al. (2019). Group 2 Innate Lymphoid Cells Participate in Renal Fibrosis in Diabetic Kidney Disease Partly via TGF-β1 Signal Pathway. Journal of Diabetes Research.?
Li X, Z. Z., Zhang Y, et al. (2018). Upregulation of lactate-inducible snail protein suppresses oncogene-mediated senescence through p16 INK4a inactivation. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research.?
Yi D, X. W., Zhang Q, et al. (2018). Human Glioblastoma-Derived Mesenchymal Stem Cell to Pericytes Transition and Angiogenic Capacity in Glioblastoma Microenvironment. Cellular Physiology and Biochemistry.
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