產(chǎn)品名稱：小鼠TNF-α ELISA試劑盒

英文名稱：Mouse TNF-α ELISA kit

產(chǎn)品貨號：EMC102a

規(guī)格：96T/96T*2/96T*5/96T*10

尊敬的客戶，感謝您選用本公司 QuantiCyto? ELISA 系列產(chǎn)品。本產(chǎn)品選用世界著名生產(chǎn)廠家的原料，采用專業(yè)體外診斷試劑生產(chǎn)技術(shù)制造，僅供科研使用。本產(chǎn)品可檢測血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、灌洗液、尿液、羊水、腹水、腦脊液、胸腔積液、組織勻漿液等多種類型樣本中天然和重組小鼠 TNF-α濃度，具體適用樣本請咨詢。使用前請仔細(xì)閱讀說明書并檢查試劑組分。如有疑問，請聯(lián)系欣博盛生物科技有限公司。Email: tech@neobioscience.com，全國服務(wù)熱線:4006 800 892。

試劑盒組成：

儲存條件：

檢測原理:

欣博盛 QuantiCyto? ELISA試劑盒采用雙抗體夾心法：抗小鼠TNF-α單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的小鼠TNF-α?xí)c單抗結(jié)合，游離的成分被洗去。加入生物素化的抗小鼠TNF-α抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，生物素與親和素特異性結(jié)合；抗小鼠TNF-α抗體與結(jié)合在單抗上的小鼠TNF-α結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應(yīng)孔中有小鼠TNF-α，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑現(xiàn)藍(lán)色，加終止液變黃。在450 nm處測OD值，小鼠TNF-α濃度與OD450值之間呈正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中小鼠TNF-α的濃度。

試驗所需自備試驗器材 (不提供，但可協(xié)助購買) :

1. 酶標(biāo)儀(450 nm波長濾光片)

2. 進(jìn)口品牌高精度加液器及一次性吸頭：0.5-10 ul, 2-20 ul, 20-200ul, 200-1000 ul。

3. 37 ℃恒溫箱, 雙蒸水或去離子水，坐標(biāo)紙等。

可協(xié)助代購相關(guān)產(chǎn)品，請咨詢。

QuantiCyto? 雙抗體夾心法ELISA原理圖：

標(biāo)本收集:

1. 收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。

2. 血漿抗凝劑推薦使用EDTA。避免使用溶血，高血脂標(biāo)本。

3. 標(biāo)本應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

4. 標(biāo)本收集后若不及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20 ℃，-70 ℃電冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融，3-6月內(nèi)檢測。

5. 如果您的樣本中檢測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請根據(jù)實際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議做預(yù)實驗，以確定稀釋倍數(shù))。

注意事項:

1. 試劑盒使用前請保存在2-8 ℃。復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品若未用完，請廢棄。

2. 濃縮生物素化抗體，濃縮酶結(jié)合物體積小，運輸中顛簸和可能的倒置，會使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。

3. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,屬于正?，F(xiàn)象，微加熱至40℃使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液。（加熱溫度不要超過50 ℃）使用時洗滌液應(yīng)為室溫。

4. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應(yīng)終止液除外）。請?zhí)崆白稍冃啦┦⑸锟萍加邢薰尽?/p>

5. 充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用最低頻率)，如無微量振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。

6. 在試驗中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測時建議作雙孔檢測。

7. 試驗中所用的試管和吸頭均為一次性使用，嚴(yán)禁在不同的液體之間混用！否則將影響試驗結(jié)果。

8. 試驗中請穿著試驗服并帶乳膠手套做好防護(hù)工作。特別是檢測血液或者其他體液標(biāo)本時，請按國家生物試驗室安全防護(hù)條列執(zhí)行。

9. 如果分次使用，請根據(jù)需要量配制各組分，以免配制過多造成浪費而影響后續(xù)試驗。剩余板孔請用封板膠紙封住，放回鋁箔袋中,2個月內(nèi)用完。

檢測前準(zhǔn)備工作:

1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫。

2. 用雙蒸水將20×濃縮洗滌液稀釋成1×工作液。未用完的放回4 ℃。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 開蓋前1000rpm離心1min。加入標(biāo)準(zhǔn)品&標(biāo)本通用稀釋液0.6ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為2000 pg/ml)。然后根據(jù)需要進(jìn)行稀釋。(建議標(biāo)準(zhǔn)曲線使用以下濃度：2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0 pg/ml)。0 pg/ml即空白孔。復(fù)溶標(biāo)準(zhǔn)品原液(2000 pg/ml）若未用完的請廢棄。

4. 生物素化抗體工作液：按當(dāng)次試驗所需要得用量，使用前20分鐘，用生物素化抗體稀釋液將30×濃縮生物素化抗體稀釋成1×工作液。當(dāng)日使用。若實驗次數(shù)過多導(dǎo)致生物素化抗體量不足，可向欣博盛公司單獨購買生物素化抗體。（須提供抗體批號）

5. 酶結(jié)合物工作液：按當(dāng)次試驗所需要的用量，使用前20分鐘，用酶結(jié)合物稀釋液將30×濃縮酶結(jié)合物稀釋成1×工作液。當(dāng)日使用。若實驗次數(shù)過多導(dǎo)致濃縮酶結(jié)合物量不足，可向欣博盛公司單獨購買濃縮酶結(jié)合物。（須提供酶結(jié)合物批號）

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法圖例：

以500 ul/管為例，用標(biāo)準(zhǔn)品&標(biāo)本通用稀釋液將復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品母液進(jìn)行倍比稀釋，具體稀釋方法如下圖，也可根據(jù)實際用量來稀釋，如200 ul/管。

洗滌方法:

1. 自動洗板機：要求注入的洗滌液為350 ul，注入與吸出間隔30－60秒。洗板5次。

2. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350 ul，靜置30秒后甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干。洗板5次。

操作步驟:

1．從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內(nèi)壓實自封條，密封口袋，放回4 ℃。

2．空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品&標(biāo)本通用稀釋液，其余相應(yīng)孔中加標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100 ul/孔)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育90分鐘。

3．提前20分鐘準(zhǔn)備生物素化抗體工作液。

4．洗板5次。

5．空白孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液(100 ul/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育60分鐘。

6．提前20分鐘準(zhǔn)備酶結(jié)合物工作液。避光室溫(22-25 ℃)放置。

7．洗板5次。

8．空白孔加酶結(jié)合物稀釋液，其余孔加入酶結(jié)合物工作液(100 ul/孔)。用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育30分鐘。

9．打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測程序。

10．洗板5次。

11．加入顯色底物(TMB)100 ul/孔，37 ℃恒溫箱，避光孵育15分鐘。

12．加入反應(yīng)終止液100 ul/孔, 混勻后即刻測量OD450值(3分鐘內(nèi))。在儀器保存讀數(shù)結(jié)果并打印一份紙質(zhì)結(jié)果。

13. 實驗完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回電冰箱保存至有效期結(jié)束。

建議保存酶標(biāo)板框，以備下次或者今后試驗使用。

結(jié)果判斷:

1. 每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去空白孔的OD值。

2. 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，手工繪制或用軟件繪制并選取最佳擬合曲線，推薦使用二次多項式方程擬合。通過標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

3. 若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計算標(biāo)本中小鼠TNF-α的含量。

靈敏度、特異性和重復(fù)性:

● 靈敏度：最小可測小鼠TNF-α達(dá)15.6 pg/ml(8次獨立重復(fù)實驗平均值)。

● 特異性：本試劑盒特異性識別天然和重組小鼠TNF-α。與以下細(xì)胞因子等無明顯交叉反應(yīng)。

● 重復(fù)性：板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<9%。

小鼠 TNF-α簡介：

早在三四十年代，人們就發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素能引起小鼠移植腫瘤的出血壞死。1975年，Carswell等人發(fā)現(xiàn)卡介苗攻擊小鼠后再用內(nèi)毒素處理，小鼠血清中出現(xiàn)一種能誘導(dǎo)腫瘤組織出血壞死的物質(zhì)，故命名為腫瘤壞死因子。TNF還稱為惡液素(cachectin)，這是因為它能引起急性或慢性感染動物的惡液質(zhì)狀態(tài)。TNF-α的生物學(xué)活性非常復(fù)雜，包括對造血、免疫和炎癥的調(diào)節(jié)；對血管和凝血的影響和對多種器官（肝、心臟、骨、軟骨、肌肉和其它組織）的作用等。TNF-α對不同的細(xì)胞有不同的作用：殺傷細(xì)胞，抑制、促進(jìn)或不影響細(xì)胞生長。TNF-α能誘導(dǎo)敏感細(xì)胞凋亡。TNF-α能快速、強烈、不可逆地抑制紅細(xì)胞系前體(CFU-ET和BFU-E)和紅系、粒系腫瘤細(xì)胞(K562、HE2、HL-60)的生長，這種抑制作用不需要淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的輔助，受抑制細(xì)胞必須表達(dá)TNF-α受體。TNF-α能促進(jìn)人的成纖維細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)EGFR和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，胰島素和EGF增強TNF-α的這一作用。TNF-α能抑制造血，引起紅細(xì)胞生成減少、破壞增加。TNF-α也能誘導(dǎo)T細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅱ類分子和高親和力IL-2受體。TNF-α能增加組織因子的表達(dá)，抑制抗凝蛋白C的輔助因子活性，從而引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的前凝血活性。TNF-α能促進(jìn)骨細(xì)胞生長和合成DNA，抑制堿性磷

酸酶活性使骨形成受阻，在骨質(zhì)吸收和重建中起重要作用。

文獻(xiàn)引用：

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Feng B, H. B., Xu Z, et al. (2019). Self-Amplified Drug Delivery with Light-Inducible Nanocargoes to Enhance Cancer Immunotherapy. Advanced Materials.?

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Hu X, Chen X, Shi X, et al. (2020). Bionanoparticle-Based Delivery in Antihypertensive Vaccine Mediates DC Activation through Lipid-Raft Reorganization. Advanced Functional Materials.

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