DC?是“Dendritic Cells”的縮寫，中文全稱為“樹突狀細胞”，因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。DC 是由2011 年諾貝爾獎獲得者、加拿大籍科學(xué)家Ralph M. Steinman 于1973 年發(fā)現(xiàn)的，是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原遞呈細胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已證實，DC 是唯一能夠顯著刺激初始T 細胞(Na?ve T cells)增殖的APC，而其它種類的APC(如單核巨噬細胞，B 細胞等)僅能刺激已活化的或記憶性的T 細胞，因此DC 是機體適應(yīng)性T 細胞免疫應(yīng)答的始動者，在腫瘤免疫中發(fā)揮著極其重要的作用。

? 雖然DC 存在于體內(nèi)多種組織中，但含量很少，無法滿足科學(xué)研究和臨床治療的需要，所以人們嘗試多種方法來體外培養(yǎng)和擴增DC。對于人，最常用的方法是從人外周血單個核細胞(PBMC)誘導(dǎo)DC 的產(chǎn)生。而對于小鼠，最常見的方法是從骨髓細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生DC，即骨髓來源的DC(Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDC)。

【步驟簡圖】

本文主要介紹：

【經(jīng)典的BMDC 培養(yǎng)法】-Inaba 法(改良)?
【BMDC大量制備法】-Son 法
【BMDC 大量制備法】-Lutz 法
【注意事項】

【經(jīng)典的BMDC 培養(yǎng)法】-Inaba 法(改良)?

背景：

1. Inaba 法獲得的BMDC 數(shù)目為5-7 x 106 個/小鼠；
2. Inaba 原法操作比較復(fù)雜，需要將骨髓中的淋巴細胞等用抗體+補體法預(yù)先去除，后來的改良法均省卻了這個步驟，其實Inaba 后來自己也說這個步驟雖然可提高BMDC 的純度，但不會對BMDC 的生成產(chǎn)生影響，可做可不做[10]；

3. Inaba 原法僅用GM-CSF 來誘導(dǎo)BMDC 的產(chǎn)生，雖然得到的BMDC 在混合淋巴細胞反應(yīng)中有較強的刺激能力，但DC 的成熟度不及GM+IL-4 的聯(lián)合誘導(dǎo)，所以后來的改良法中多用GM+IL-4 聯(lián)合誘導(dǎo)。

培養(yǎng)步驟：

1. 小鼠骨髓細胞的獲得
1.1 小鼠(6 - 10 周齡)頸椎脫臼法處死，手術(shù)取出所有股骨(femurs)和脛骨(tibias)，并剪刀和鑷子將骨周圍的肌肉組織盡量去除干凈；
注：不要損傷到骨。
1.2 將骨移至超凈臺內(nèi)，并用盛有70%酒精的無菌培養(yǎng)皿浸泡2-5min，以消毒滅菌，然后用無菌的PBS 洗2 次；
1.3 將骨移入另一個盛有PBS 的新培養(yǎng)皿中，用剪刀剪去骨兩端，再用注射器抽取PBS，針頭分別從骨兩端插入骨髓腔，反復(fù)沖洗出骨髓至培養(yǎng)皿中，直至
骨完全變白；
1.4 收集骨髓懸液，用200 目尼龍網(wǎng)濾去小碎片和肌肉組織；
1.5 濾過液1200 rpm 離心5min，棄上清；
1.6 加入2 ml 氯化銨紅細胞裂解液(1x)，重懸細胞，室溫孵育3-5min，最長10min；

氯化銨紅細胞裂解液的配制：
1. 先配制10x的貯存液，配法如下：
稱取82.9g NH4Cl，10.0gKHCO3和0.37g Na2EDTA，溶于1L的蒸餾水中，0.22μm濾膜過濾除菌，4oC儲存6個月；
注：可根據(jù)需要配制適量的10x貯存液，其中各組分需成比例增減。
2. 臨用前，將10x貯存液用無菌蒸餾水1 : 9稀釋成1x工作液即可。?注：因氯化銨紅細胞裂解液對骨髓細胞有一定的傷害作用，所以要盡量縮短溶血時間。
1.7 加入10 ml PBS 中和裂解液的作用，然后1200 rpm 離心5min，棄上清;
1.8 PBS 洗1 次，然后用含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)液重懸細胞，至此已獲得小鼠骨髓細胞。
2. BMDC 的誘導(dǎo)分化

2.1 步驟1 中獲得的小鼠骨髓細胞計數(shù)后用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為0.5-1 x 106/ml；
2.2 鋪至24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1ml 細胞，同時加入重組小鼠GM-CSF (20ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)，37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，此為培養(yǎng)的第0 天；
注：1) 一般一只小鼠大約可收獲4-5 x 107個骨髓細胞，所以可以鋪至少40-50個24 孔板板孔。
? ? ? ? 2) GM-CSF 和IL-4 的使用濃度區(qū)間分別為20-50ng/ml 和10-40ng/ml。
2.3 每2 天輕輕搖晃培養(yǎng)板，然后3/4 體積更換新鮮培養(yǎng)液，并補足細胞因子。
2.4 在第5 天和第8 天之間，輕柔吹打培養(yǎng)液，收集懸浮細胞及巰松貼壁生長的細胞；
2.5 1200 rpm 離心5min，棄上清；
2.6 用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培養(yǎng)液重懸細胞并計數(shù)，然后調(diào)整細胞濃度至1 x 106/ml，并加入重組小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)；
2.7 細胞鋪板至100 mm 培養(yǎng)皿(每皿最多10ml)或6 孔培養(yǎng)板(2m/孔)。
2.8 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1-2 天；
2.9 收集懸浮細胞，即為較成熟的BMDC。

3. BMDC 的完全成熟
注：步驟2 中獲得的BMDC 并非完全成熟的DC，若想得到完成成熟的DC，還需LPS，CD40L 或TNF-a 等的誘導(dǎo)。
3.1 步驟2.4 或2.9 中獲得的BMDC 以1200rpm 離心5min，棄上清；
3.2 用含重組小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)的RPMI 完全培養(yǎng)液重懸沉淀，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為1 x 106/ml；
3.3 加入24 孔培養(yǎng)板中，并加入成熟誘導(dǎo)劑，如TNF-α (250U/ml)，LPS (1μg/ml)、或CD40L(1μg/ml)等；
3.4 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 天；
3.5 收集懸浮細胞及疏松貼壁生長的細胞即為成熟樹突狀細胞。

【BMDC 大量制備法】-Son 法

背景：

1. 該法可在7 天內(nèi)獲得30-40 x 106 個DC/小鼠，是Inaba 經(jīng)典方法的7-10 倍。DC經(jīng)14.5%甲泛葡胺(Metrizamide)梯度離心后，純度(即CD11c+/I-Ab+細胞)可達85-95%。
2. 該法獲得的DC 的內(nèi)吞能力弱于Inaba 經(jīng)典方法，但分泌的IL-12p70 量相似；
3. 該法獲得的DC 在混合淋巴細胞反應(yīng)中比Inaba 經(jīng)典方法呈現(xiàn)更強的刺激能力；
4. 該法獲得的DC 能引起更強的特異性T 細胞反應(yīng)；
5. 以上結(jié)果提示，該法比經(jīng)典方法能獲得更多、更成熟的BMDC。

培養(yǎng)步驟：

1. 小鼠骨髓細胞的獲得
見Inaba 法(改良)中的相應(yīng)步驟。

2. BMDC 的大量制備
2.1 步驟1 中獲得的小鼠骨髓細胞計數(shù)后用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2 x 105/ml；
2.2 鋪至6 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔5ml 細胞，同時加入重組小鼠GM-CSF (1000U/ml)和IL-4 (1000U/ml)，37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
2.3 在培養(yǎng)的第4 天，向培養(yǎng)體系中補充重組小鼠GM-CSF (1000U/ml)和IL-4(1000U/ml)；
2.4 培養(yǎng)的第7 天收集DC，用2-4ml RPMI 1640 完全培養(yǎng)液重懸，加至等體積的14.5%(w/v) 甲泛葡胺上，1200 x g 室溫離心20min；
注：此時的DC 為不完全成熟的BMDC，要想進一步成熟，請?zhí)敛襟E3。
2.5 收集中間層，并用RPMI 1640 完全培養(yǎng)液洗3 次備用。
3. BMDC 的完全成熟
3.1 步驟 2.4 中收集的BMDC，重新鋪板，并向培養(yǎng)體系中加入重組小鼠GM-CSF(1000U/ml)和IL-4 (1000U/ml)，以及LPS (1-10μg/ml)
3.2 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 天，獲得成熟的BMDC。

【BMDC 大量制備法】-Lutz 法

背景：

1. Lutz 法與Son 法相似，均可大量制備BMDC，但與Son 法相比，Lutz 法更為廣泛地被采用。
2. 該法可獲得更多的BMDC，達1-3 x 108 個/小鼠，而且純度可達90-95%；
3. 該法比Son 法使用的細胞因子濃度低得多，僅為200U/ml，而且培養(yǎng)的第8 天到第10 天降為30-100U/ml，這樣可以大幅節(jié)約試劑成本；
4. 該法與Inaba 經(jīng)典方法和Son 法的最大不同是使用細菌培養(yǎng)皿(Petri dish)而非細胞培養(yǎng)板來培養(yǎng)骨髓細胞。Inaba 的解釋是細菌培養(yǎng)皿不容易使骨髓中的巨噬細胞貼壁，從而抑制巨噬細胞的發(fā)育，進而避免巨噬細胞對DC 成熟的抑制作用，這可能是該法能夠以較低鋪板密度獲得大量BMDC 的主要原因。
5. 但該法的培養(yǎng)時間較長，需要10-12 天，一方面是為了獲得更多的BMDC，另一方面，大多數(shù)粒細胞和淋巴細胞很難存活這么長時間，因此可提高最終獲得的BMDC 的純度；
6. 該法僅用GM-CSF 進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到的BMDC 中未成熟和成熟DC 均有，若要進一步提高成熟度，需用LPS 或TNF-α再誘導(dǎo)1-2 天，其中成熟DC 細胞的含量將達到50-70%。

培養(yǎng)步驟：

1. 小鼠骨髓細胞的獲得
見Inaba 法(改良)中的相應(yīng)步驟，注意省去溶血步驟。

2. BMDC 的大量制備
2.1 步驟1 中獲得的小鼠骨髓細胞計數(shù)后用含10% FBS 的RPMI 1640 完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2 x 105/ml；
2.2 鋪至100mm 細菌培養(yǎng)皿(Petri Dish)中，每皿10ml 細胞，同時加入重組小鼠GM-CSF (200U/ml，對于PeproTech 的GM-CSF，相當(dāng)于20ng/ml)，37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
注：此處使用的是細菌培養(yǎng)皿，而非細胞培養(yǎng)板。
2.3 第3 天時，向培養(yǎng)皿中再加入10ml 含20ng/ml 重組小鼠GM-CSF 的完全培養(yǎng)液；
2.4 第6 天和第8 天分別半量換液，即收集舊培養(yǎng)液，離心后用含20ng/ml 重組小鼠GM-CSF 的完全培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，然后再將細胞懸液放回原皿；
2.5 第10 天時可收集細胞，即為BMDC。

3. BMDC 的完全成熟
3.1 培養(yǎng)第10 天的DC 用移液器輕輕吹打收集懸浮細胞，300 x g 室溫離心5min；

3.2 棄上清，用10ml RPMI 1640 完全培養(yǎng)液重懸細胞沉淀，然后鋪于100 mm 細胞培養(yǎng)板；

3.3 加入重組小鼠GM-CSF(100U/ml ， 相當(dāng)于PeproTech 的10ng/ml) 和TNF-α (500U/ml)，或重組小鼠GM-CSF(100U/ml，相當(dāng)于PeproTech 的10ng/ml)和LPS (1μg/ml)；
3.4 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1-2 天。

【BMDC 的鑒定】

1. 形態(tài)學(xué)觀察：BMDC 多數(shù)呈集落生長，細胞有多個樹突樣突起，成熟的BMDC 更加明顯；
2. 細胞表型分析：流式細胞術(shù)檢測DC 細胞表面CD11c，CD40，CD80，CD86，MHCII 類分子(I-A/I-E)等的表達，BMDC 高表達這些分子，完全成熟的BMDC 中這些分子的表達會進一步提高。
3. 混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)：BMDC 具有較強的刺激能力，且成熟度越高，刺激能力越強。

【注意事項】

1. 小鼠品系和性別：
多數(shù)研究表明，所使用的小鼠品系與獲得BMDC 的數(shù)量和成熟度關(guān)系不大，但也有研究表明C57BL/6 小鼠可能更好。
Lutz 表示從C57BL/10，DBA/2，C3H/J 和129 等小鼠品系均可獲得足夠數(shù)量和純度的BMDC，但Lutz 在其實驗中更傾向于使用C57BL/6，ICR 和BALB/c 小鼠，且發(fā)現(xiàn)C57BL/6 小鼠的BMDC 產(chǎn)量最高，而且ICR 小鼠和C57BL/6 小鼠的BMDC 對LPS的成熟誘導(dǎo)敏感度高于BALB/c 小鼠。
關(guān)于小鼠的性別，Inaba 認為雄性小鼠更好些，因為他們的骨骼更大，從而可以獲得更多的前體細胞，但多數(shù)學(xué)者更傾向于使用雌性小鼠。因此，目前培養(yǎng)BMDC 用的比較多的小鼠是雌性或雄性C57BL/6 小鼠。

2. 單獨使用GM-CSF 還是聯(lián)合使用IL-4?
Inaba 經(jīng)典法和Lutz 大量制備法中均僅用GM-CSF 即可誘導(dǎo)出相當(dāng)數(shù)量的BMDC，而且也在混合淋巴細胞反應(yīng)中表現(xiàn)出較強的刺激作用，但其實這些BMDC 的成熟度并不足夠高。
研究顯示，GM-CSF+IL-4 聯(lián)合誘導(dǎo)比GM-CSF 單獨誘導(dǎo)產(chǎn)生的BMDC 表達更高的MHC II 類分子和共刺激分子CD80 和CD86 等，提示前者具有更強的抗原遞呈能力，而且前者在混合淋巴細胞反應(yīng)中表現(xiàn)出更有效的刺激能力。在動物實驗中也發(fā)現(xiàn)，GM-CSF+IL-4 聯(lián)合誘導(dǎo)的BMDC 可產(chǎn)生保護性抗腫瘤免疫反應(yīng)，而GM-CSF 單獨誘導(dǎo)的BMDC 的保護性較弱，這些都說明GM-CSF+IL-4 聯(lián)合誘導(dǎo)的BMDC 的成熟度高于GM-CSF 單獨誘導(dǎo)的BMDC。
德國明斯特大學(xué)(University of Munster)的Labeur 研究也表明，單獨用GM-CSF 誘導(dǎo)的BMDC 為未成熟DC，GM-CSF 和IL-4 聯(lián)合誘導(dǎo)產(chǎn)生的BMDC 的成熟度居中，添加CD40L 或LPS 可進一步誘導(dǎo)BMDC 完全成熟。

因此筆者認為，要想獲得功能更好的BMDC，最好用GM-CSF 和IL-4 聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓細胞。而且，如果能在Inaba 經(jīng)典法和Lutz 大量制備法中添加IL-4，應(yīng)該會獲得更加成熟、有效的BMDC。

3. 成熟誘導(dǎo)劑的選擇

LPS，CD40L 和TNF-α無論對人DC 還是小鼠DC 均是常用、有效的成熟誘導(dǎo)劑，那么應(yīng)該選擇哪個呢？
TNF-a 誘導(dǎo)DC 的成熟能力在三者中最弱[7,8]。LPS 和CD40L 均是DC 體外完全成熟的強誘導(dǎo)劑，兩者誘導(dǎo)DC 的成熟度相似，但誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞因子譜有差異。CD40L誘導(dǎo)成熟的BMDC 在體內(nèi)顯示出最強的免疫調(diào)節(jié)能力，包括保護性和治療性腫瘤免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。
用LPS 刺激DC 完全成熟所用的濃度一般為1-10μg/ml，但其實0.1 μg/ml 已經(jīng)有非常強的作用，但保險起見，一般選用1μg/ml。
對于CD40L 需要注意的是，CD40L 分子屬于TNF 配體家族，該家族的特點是在形成三聚體后才能發(fā)揮作用。所以最好能用重組的CD40L 三聚體蛋白來刺激DC，這樣會有很好的效果。如果用CD40L 單體來刺激DC，多數(shù)情況下成熟度并不是很高。

4. 培養(yǎng)方法的選擇

【BMDC 相關(guān)試劑推薦】

注：用于DC 鑒定的表面標志物的表達在流式圖上均呈現(xiàn)單個峰，且多數(shù)情況下不能與陰性峰完全區(qū)分開來。為避免多色分析時補償調(diào)節(jié)不好導(dǎo)致結(jié)果的不準確性，建議最好用單標，最多用雙標來做DC 表面標志的分析，而且必須使用同型對照，而非空白細胞對照來排除背景染色。

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