? 基因篩選抗生素常見問題

多種篩選抗生素可以用于同一細(xì)胞系嗎？

可以的，所有的篩選抗生素均可同時(shí)或任意組合使用。

為什么在初始細(xì)胞培養(yǎng)的過程中不推薦使用篩選抗生素？

我們建議在細(xì)胞傳代兩次之前不要添加篩選抗生素，因?yàn)榧?xì)胞在初始培養(yǎng)過程中是脆弱的，抗生素可能會(huì)降低細(xì)胞活力。并且耐藥標(biāo)記的充分表達(dá)使細(xì)胞獲得對這些篩選抗生素的耐藥性是非常重要的。

如何停用Invivogen的篩選抗生素？

對于停用Invivogen所有的篩選抗生素（Zeocin?, Hygromycin, G418, Phleomycin, Puromycin, and Blasticidin），建議如下：

●?在培養(yǎng)基中加入5%的NaOH（氫氧化鈉）和0.1%的NaClO（次氯酸鈉）。

●?在室溫放置5-10分鐘。

該操作能有效地使培養(yǎng)基中的所有抗生素失效。

可以提供Invivogen篩選抗生素在細(xì)胞培養(yǎng)基中的半衰期數(shù)據(jù)嗎？

非常抱歉，Invivogen沒有關(guān)于篩選抗生素在細(xì)胞培養(yǎng)中的半衰期數(shù)據(jù)。Invivogen在測試時(shí)是在新鮮培養(yǎng)，而非儲(chǔ)備培養(yǎng)基中添加篩選抗生素的。但是如果有需要的話，可以在培養(yǎng)基中補(bǔ)充篩選抗生素，并儲(chǔ)存于4℃，儲(chǔ)存時(shí)間不超過一周。

應(yīng)該如何儲(chǔ)存Invivogen的篩選抗生素？

Invivogen所有的篩選抗生素均在室溫下運(yùn)輸，收到之后，可置于4℃短期儲(chǔ)存，若要長期儲(chǔ)存需置于-20℃。避免重復(fù)凍融循環(huán)。有效期在產(chǎn)品標(biāo)簽上。

開封之后，在-20℃下可穩(wěn)定一年時(shí)間，但需避免凍融循環(huán)。在4℃無菌條件下可穩(wěn)定3個(gè)月的時(shí)間。

Invivogen各類篩選抗生素的特性。

??Hygromycin B Gold（潮霉素B）

技術(shù)資料中只有Hygromycin B Gold（潮霉素B）在低鹽LB培養(yǎng)基中推薦的使用濃度為50-100 ug/ml,但是實(shí)驗(yàn)室中只有高鹽的LB培培養(yǎng)基，那應(yīng)該使用多少濃度的Hygromycin B Gold（潮霉素B）呢？

Invivogen推薦在高鹽LB的培養(yǎng)基中使用100 – 150 μg/mL的Hygromycin B Gold（潮霉素B）。

將Hygromycin B Gold（潮霉素B）用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，應(yīng)使用什么濃度？

將Hygromycin B Gold（潮霉素B）用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)推薦的使用濃度為50-200 ug/ml，也有少數(shù)參考文獻(xiàn)中提到的使用濃度高達(dá)500 ug/ml。建議在正式實(shí)驗(yàn)開始前，先確定可殺死宿主細(xì)胞系所需要的Hygromycin B Gold（潮霉素B）的最佳濃度。Hygromycin B Gold（潮霉素B）的常用劑量為200 ug/ml，即將原液稀釋500倍。關(guān)于更多的細(xì)節(jié)信息，請參考該產(chǎn)品的說明書。

將Hygromycin B Gold（潮霉素B）用于大腸桿菌時(shí)，應(yīng)使用什么濃度？

在低鹽LB培養(yǎng)基中推薦使用50-100 ug/ml的Hygromycin B Gold（潮霉素B）篩選耐潮霉素轉(zhuǎn)化菌株。含有Hygromycin B Gold（潮霉素B）的平板培養(yǎng)基可在4℃下穩(wěn)定1個(gè)月。

??Zeocin?（博萊霉素）

Invivogen提供的Zeocin?（博萊霉素）是硫酸的還是鹽酸的？

Invivogen提供的是硫酸Zeocin?（博萊霉素）。

Zeocin?（博萊霉素）是光敏的嗎？

不是的，Zeocin?（博萊霉素）不是光敏的。

Zeocin?（博萊霉素）對pH敏感嗎？

是的，Zeocin?（博萊霉素）對pHshiite敏感的，其在低pH值和高pH值(<6和>8)或弱氧化劑存在下會(huì)發(fā)生不可逆變性。

將Zeocin?（博萊霉素）稀釋至工作濃度，推薦使用什么緩沖液？

將Zeocin?（博萊霉素）稀釋至工作濃度時(shí)推薦使用無菌水。

推薦使用什么濃度的HEPES緩沖液去重懸Zeocin?（博萊霉素）？

用于重懸Zeocin?（博萊霉素）的HEPES緩沖液濃度為5 g/L.

Zeocin?（博萊霉素）應(yīng)如何儲(chǔ)存？

Zeocin?（博萊霉素）在室溫條件下運(yùn)輸，收到之后，可置于4℃短期儲(chǔ)存，若要長期儲(chǔ)存請置于-20℃。

避免重復(fù)凍融循環(huán)，有效期在產(chǎn)品標(biāo)簽上。

對于粉末狀的Zeocin?（博萊霉素），一旦重懸至100 mg/mL，可在4℃條件下儲(chǔ)存12個(gè)月，在-20℃條件下儲(chǔ)存18個(gè)月。

對于溶液狀的Zeocin?（博萊霉素），開封后，可在-20℃下可穩(wěn)定一年時(shí)間，但需避免凍融循環(huán)。在4℃下可穩(wěn)定3個(gè)月的時(shí)間，但需置于無菌條件。

將Zeocin?（博萊霉素）用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，應(yīng)使用什么濃度？

將Zeocin?（博萊霉素）用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞系時(shí)推薦的使用濃度為50-400 ug/ml，也有少數(shù)參考文獻(xiàn)中提到的使用濃度低至20 ug/mL，或高至1000 ug/mL。建議在正式實(shí)驗(yàn)開始前，先確定可殺死宿主細(xì)胞系所需要的Zeocin?（博萊霉素）的最佳濃度。關(guān)于更多的細(xì)節(jié)信息，請參考該產(chǎn)品的說明書。

將Zeocin?（博萊霉素）用于大腸桿菌時(shí)，應(yīng)使用什么濃度？

在低鹽LB培養(yǎng)基中推薦使用25 ug/mL的Zeocin?（博萊霉素）篩選耐博萊霉素轉(zhuǎn)化菌株。

注意：不要使用含Tn5轉(zhuǎn)座因子的大腸桿菌菌株，如MC1066。因?yàn)門n5編碼博萊霉素抗性基因，是大腸桿菌菌株對Zeocin?（博萊霉素）產(chǎn)生抗性。

??Phleomycin（腐草霉素）

Phleomycin（腐草霉素）應(yīng)如何儲(chǔ)存？

Phleomycin（腐草霉素）室溫條件下運(yùn)輸，收到之后，可置于4℃短期儲(chǔ)存，若要長期儲(chǔ)存請置于-20℃。

避免重復(fù)凍融循環(huán)，有效期在產(chǎn)品標(biāo)簽上。

對于粉末狀的Phleomycin（腐草霉素），一旦重懸至20 mg/mL，可在4℃條件下儲(chǔ)存12個(gè)月，在-20℃條件下儲(chǔ)存18個(gè)月。

對于溶液狀的Phleomycin（腐草霉素），開封后，可在-20℃下可穩(wěn)定一年時(shí)間，但需避免凍融循環(huán)。在4℃下可穩(wěn)定3個(gè)月的時(shí)間，但需置于無菌條件。

將Phleomycin（腐草霉素）用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，應(yīng)使用什么濃度？

將Phleomycin（腐草霉素）用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞系時(shí)推薦的使用濃度為5-50 ug/ml。建議在正式實(shí)驗(yàn)開始前，先確定可殺死宿主細(xì)胞系所需要的Phleomycin（腐草霉素）的最佳濃度。關(guān)于更多的細(xì)節(jié)信息，請參考該產(chǎn)品的說明書。

將Phleomycin（腐草霉素）用于大腸桿菌時(shí)，應(yīng)使用什么濃度？

在低鹽LB培養(yǎng)基中推薦使用5 ug/mL的Phleomycin（腐草霉素）篩選耐腐草霉素轉(zhuǎn)化菌株。

注意：一般大腸桿菌受體菌株（如HB101、DH5α、MC1061）與攜帶博萊霉素耐藥基因（如Sh ble、 Tn5）的載體轉(zhuǎn)化可對Phleomycin（腐草霉素）產(chǎn)生抗性。

??G418（遺傳霉素）

同時(shí)購買的兩瓶G418遺傳霉素均置于-20℃儲(chǔ)存，為什么其中一瓶會(huì)凝結(jié)成固體，而另外一瓶則是完全透明的液體？

Invivogen實(shí)驗(yàn)室也有注意到同樣的現(xiàn)象。由于液體的結(jié)冰反應(yīng)需要擾動(dòng)才可以進(jìn)行，所以即使在0℃以下，溶液的結(jié)冰反應(yīng)也不可自發(fā)進(jìn)行。這種擾動(dòng)可以是震動(dòng)、沖擊等。因此不同管G418凝固的差異可以解釋為對其中一管的G418有一個(gè)小的沖擊或震動(dòng)，而未碰觸到其他管。

注意，液體中的凝固反應(yīng)是一個(gè)連鎖反應(yīng)，一旦發(fā)生便可迅速擴(kuò)散到整個(gè)可用的溶液。

應(yīng)如何讓儲(chǔ)存G418?

G418在室溫下運(yùn)輸。收到之后，請置于4℃短期儲(chǔ)存，若要長期儲(chǔ)存請置于-20℃。避免重復(fù)凍融循環(huán)，有效期在產(chǎn)品標(biāo)簽上。

一旦拆封，-20℃條件下儲(chǔ)存可穩(wěn)定一年，期間需避免重復(fù)凍融循環(huán)。4℃無菌條件下儲(chǔ)存可穩(wěn)定3個(gè)月。

將G418用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，應(yīng)使用什么濃度？

G418用于篩選和維護(hù)轉(zhuǎn)染neo基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的工作濃度取決于多種因素，例如細(xì)胞類型。因此，我們建議正式實(shí)驗(yàn)開始之前使用不同濃度的抗生素（例如100 ug/mL- 1 mg/mL）處理細(xì)胞，以確定殺死宿主細(xì)胞系所需的最佳抗生素濃度。請注意：G418常用劑量為400 ug/mL。

是否可以使用G418在大腸桿菌中篩選含有Neo基因的質(zhì)粒？

不可以的。G418只能在表達(dá)Neo基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用。對篩選表達(dá)Neo基因的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子建議使用 Kanamycin（卡那霉素）。

??Puromycin（嘌呤霉素）

應(yīng)使用什么緩沖液重懸Puromycin（嘌呤霉素）？

Invivogen推薦使用HEPES緩沖液 （5 mM, pH 7.3）重懸Puromycin（嘌呤霉素）。

將Puromycin（嘌呤霉素）置于-20℃儲(chǔ)存時(shí)出現(xiàn)結(jié)晶固體，是否正常？

是正常的，在儲(chǔ)存過程中可能會(huì)形成Puromycin（嘌呤霉素）的結(jié)晶沉淀。如果發(fā)生此情況，請將產(chǎn)品置于37℃下加熱30分鐘，直到結(jié)晶沉淀消失。結(jié)晶沉淀的形成并不影響產(chǎn)品的活性。

應(yīng)如何儲(chǔ)存Puromycin（嘌呤霉素）?

Puromycin（嘌呤霉素）在室溫下運(yùn)輸。收到之后，可置于4℃短期儲(chǔ)存，若要長期儲(chǔ)存請置于-20℃。避免重復(fù)凍融循環(huán)，有效期在產(chǎn)品標(biāo)簽上。

一旦拆封，-20℃條件下儲(chǔ)存可穩(wěn)定一年，期間需避免重復(fù)凍融循環(huán)。4℃無菌條件下儲(chǔ)存可穩(wěn)定3個(gè)月。

將Puromycin（嘌呤霉素）用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，應(yīng)使用什么濃度？

Puromycin（嘌呤霉素）用于篩選哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的工作濃度為1-10 ug/mL。我們建議正式實(shí)驗(yàn)開始之前使用不同濃度的抗生素處理細(xì)胞，以確定殺死宿主細(xì)胞系所需的最佳抗生素濃度。請注意：Puromycin（嘌呤霉素）能迅速殺死不含pac基因的真核細(xì)胞。更多的細(xì)節(jié)信息，請參考本產(chǎn)品說明書。

將Puromycin（嘌呤霉素）用于大腸桿菌時(shí)，應(yīng)使用什么濃度？

Puromycin（嘌呤霉素）對大腸桿菌具有很低的活性，但是當(dāng)?shù)望}LB培養(yǎng)基的pH在7.5-8之間時(shí)，可使用100-125 ug/mL的Puromycin（嘌呤霉素）篩選耐嘌呤霉素轉(zhuǎn)化菌株。

??Blasticidin（殺稻瘟菌素）

應(yīng)如何儲(chǔ)存Blasticidin（殺稻瘟菌素）？

Blasticidin（殺稻瘟菌素）在室溫下運(yùn)輸。收到之后，可置于4℃短期儲(chǔ)存，若要長期儲(chǔ)存請置于-20℃。避免重復(fù)凍融循環(huán)，有效期在產(chǎn)品標(biāo)簽上。

一旦拆封，-20℃條件下儲(chǔ)存可穩(wěn)定一年，期間需避免重復(fù)凍融循環(huán)。4℃無菌條件下儲(chǔ)存可穩(wěn)定3個(gè)月。

注意：對于粉末狀的Blasticidin（殺稻瘟菌素），若重懸之后儲(chǔ)存，其濃度必須大于或等于10 mg/mL才可在-20℃的條件下穩(wěn)定1年，需注意避免重復(fù)凍融循環(huán)。如果儲(chǔ)存時(shí)濃度低于10 mg/mL,則無法保證該產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

將Blasticidin（殺稻瘟菌素）用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，應(yīng)使用什么濃度？

Blasticidin（殺稻瘟菌素）用于篩選哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的工作濃度為1-10 ug/mL，也有少數(shù)參考文獻(xiàn)中的使用濃度高達(dá)30 ug/mL。我們建議正式實(shí)驗(yàn)開始之前使用不同濃度的抗生素處理細(xì)胞，以確定殺死宿主細(xì)胞系所需的最佳抗生素濃度。更多的細(xì)節(jié)信息，請參考本產(chǎn)品說明書。

將Blasticidin（殺稻瘟菌素）用于大腸桿菌時(shí)，應(yīng)使用什么濃度？

Blasticidin（殺稻瘟菌素）對大腸桿菌具有很低的活性，但是當(dāng)?shù)望}LB培養(yǎng)基的pH為8時(shí)，可使用100 ug/mL的Blasticidin（殺稻瘟菌素）篩選耐殺稻瘟菌素轉(zhuǎn)化菌株。注意：高pH值可提高殺稻瘟菌素的活性。

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