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免疫組化IHC常見問題

2021-06-23
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IHC信號微弱/無信號
問題解決方案
抗體效力a.?抗體效價(jià)不高??赏ㄟ^增加抗體使用濃度,延長抗體孵育時(shí)間進(jìn)行調(diào)整。
b.?
所用抗體不適用于IHC實(shí)驗(yàn)。建議在非變性WB上測試該抗體,以確??贵w識別非變性抗原,或是選用通過IHC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的抗體。
c.?
一抗二抗不匹配。使用針對一抗物種來源的二抗,如一抗宿主為rabbit,則須使用anti-rabbit的二抗。
d.?
抗體失活。避免將標(biāo)記熒光基團(tuán)的二抗放置于光照環(huán)境。
酶底物失活或呈色時(shí)波長設(shè)置錯(cuò)誤a.?顯色溶液失去作用,可能是由于底物緩沖液中含有酶抑制劑,或底物緩沖液的pH值不適當(dāng)。建議取一滴二抗標(biāo)記酶與底物溶液反應(yīng),?可確認(rèn)顯色溶液是否失去活性。
b.?
錯(cuò)誤的激發(fā)波長。呈色前確保激發(fā)波長與使用的熒光基團(tuán)相匹配。
樣品制備問題a.?脫蠟作用不足。建議延長脫蠟時(shí)間,使用新鮮配制的二甲苯。
b.?
固定液(福爾馬林或?PFA)?可能改變表位。建議利用抗原修復(fù)方式使表位暴露出來或縮短固定作用的時(shí)間。
c.?
固定作用不適當(dāng)。避免延遲固定或過度固定,一般建議至少固定6小時(shí)以上,18~24小時(shí)已可滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。
d.?
冰凍切片樣品保存期過長。冰凍切片制備完成后,最好于1-2個(gè)月內(nèi)用完,超過6個(gè)月的話,建議制備新的玻片。
e.?
熒光染色樣品保存不當(dāng)。熒光基團(tuán)在光線下暴露時(shí)間過長,可能會導(dǎo)致信號減弱,建議在避光環(huán)境下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和保存樣品,也可使用防熒光淬滅的封片劑封固樣本。
樣品屬性a.?靶蛋白含量低。建議設(shè)置為陽性対照組,增加抗體使用量或利用放大步驟來放大信號。
b.?
靶蛋白為核蛋白而抗體不能穿透細(xì)胞核。建議在封閉溶液與抗體稀釋液中加入滲透試劑,以促進(jìn)抗體滲透到細(xì)胞內(nèi)。
c.?
靶蛋白為膜蛋白而表位可能因?yàn)闈B透作用被破壞或移除。建議將緩沖液中的滲透試劑減少或移除。
d.?
較厚的組織。如斑馬魚全胚胎或染色建議做細(xì)胞破膜,以便抗體順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。
關(guān)鍵步驟:在每次的實(shí)驗(yàn)中,設(shè)置陽性與陰性對照組,以確認(rèn)是該次實(shí)驗(yàn)的抗體、試劑、組織切片、實(shí)驗(yàn)過程的問題,還是靶蛋白自身表達(dá)量低的問題。
IHC非特異性染色/背景值比較高
問題解決方案
固定方式或組織自身可能存在自發(fā)熒光a.?嘗試用非醛類替代醛類。
b.?
用淬滅自發(fā)熒光的染料或方法處理組織樣品:如硼氫化鈉、短波長的UV照射、蘇丹黑等。
c.?
將石蠟包埋樣品的方法換成冰凍切片(OCT或明膠),減少固定液的影響。
d.?
選擇不會與自發(fā)熒光競爭的熒光染料。福爾馬林、PFA或戊二醛等會產(chǎn)生高背景的熒光,尤其在使用綠色、藍(lán)色和紅色波長光譜范圍時(shí);組織中的紅細(xì)胞或膠原蛋白等組分會產(chǎn)生很強(qiáng)的自發(fā)熒光,尤其是使用綠色和紅色通道的熒光檢測時(shí)。
e.?
組織沖洗不徹底,有固定液殘留。
f.?
使用福爾馬林或PFA固定過久。一般建議至少固定6小時(shí)以上,18~24小時(shí)已可滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用,注意:如固定時(shí)間到了無法繼續(xù)后續(xù)脫水、包埋程序,一定要將組織置換到PBS保存,切勿一直泡于固定液中,否則有可能造成蛋白交聯(lián)無法修復(fù)。
g.?
配置新鮮的固定液
封閉、洗脫或顯色問題a.?增加封閉液濃度、延長封閉時(shí)間。
b.?
更換封閉液成分,注意:?封閉液成分不可與一抗物種同來源,最好與二抗物種同源,如二抗來自馬血清,使用馬血清可得到較干凈的背景。
c.?
底物過量:縮短底物孵育時(shí)間。
d.?
信號過度放大:縮短信號放大試劑孵育時(shí)間。
e.?
洗脫液不適合:如果原本是用PBS,可更換使用TBS
抗體濃度太高或非特異性結(jié)合a.?降低抗體濃度,如1100調(diào)整為11000
b.?
縮短抗體孵育時(shí)間,并在4°c?孵育。
c.?
增加封閉緩沖液濃度。
d.?
做多個(gè)目標(biāo)蛋白染色時(shí),建議使用預(yù)吸附二抗減少與其他物種一抗的交互作用。
e.?
針對二抗與組織發(fā)生非特異性結(jié)合的情況建議每次實(shí)驗(yàn)都要設(shè)置一組不加一抗,只加二抗的對照組,才能確認(rèn)信號是來自高背景值還是真實(shí)信號。
內(nèi)源性酶(過氧化氫酶或堿性磷酸酶)a.?使用酶抑制劑。
-?
過氧化物酶:使用H2O2 (0.3% v/v)
-?
堿性磷酸酶:使用?Levamisol (2 mM)
內(nèi)源性生物素?Avidin?孵育以封閉生物素
組織問題a.?脫蠟不完全,可能導(dǎo)致細(xì)胞核染色在呈相時(shí)模糊,亦可能導(dǎo)致抗體無法辨認(rèn)抗原或者高背景值。
b.?
抗原修復(fù)方式不適合,建議更換修復(fù)溶液成分或方法。
c.?
一抗與組織物種同源。較常發(fā)生在使用鼠源抗體染鼠源組織時(shí),除了避開同樣物種來源的一抗和組織之外,也可以使用?Mouse-on-Mouse IHC染色試劑盒?(GTX83396)?迸行實(shí)驗(yàn)。
d.?
任何時(shí)候都不要讓組織干掉。
IHC實(shí)驗(yàn)結(jié)果形態(tài)不佳
問題解決方案
組織切片從載玻片上脫落a.?使用新鮮配制、適當(dāng)帶電或疏水處理過的載玻片。
b.?
石蠟切片貼于載玻片后,于60°C烘烤3-5小時(shí)最為合適,烘烤不足容易掉片。
c.?
實(shí)驗(yàn)過程中要輕柔沖洗載玻片上的組織。
組織切片撕裂、褶皺或有氣泡a.?切片刀鈍或是刀刃上有缺口。建議使用鋒利刀片重新制備切片。
b.?
刀刃上有蠟屑的積留,請隨時(shí)將廢屑?xì)堅(jiān)妹⑶宄蓛簟?/span>
c.?
刀沒夾緊或刀的角度傾斜。適當(dāng)調(diào)節(jié)切片刀的角度,并確認(rèn)刀片和蠟塊都有夾緊。
d.?
移動刀座,如果劃痕還是出現(xiàn)在相同位置,應(yīng)該是組織標(biāo)本內(nèi)有污物或硬物的問題。
e.?
確認(rèn)組織無過度脫水,并調(diào)節(jié)適當(dāng)切片速度。
f.?
在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí),避免損壞切片區(qū)域。
g.?
避免展片時(shí)于載玻片上形成的氣泡。
組織形態(tài)分辨率差a.?制備較薄的切片。一般來說,冰凍切片的片子較厚(約10-30 um),一般設(shè)定刀片溫度為-10~-20度,如設(shè)定溫度太低,可能會切不好;石蠟切片的片子較?。s5-10 um)。
b.?
確認(rèn)已使用適當(dāng)厚度的蓋玻片,如使用油鏡一定要滴油。
c.?
建議使用激光共聚焦顯微鏡成像,去除非焦點(diǎn)平面的噪質(zhì)。
固定不完全或造成物理損傷a.?增加固定時(shí)間。如使用4 % PFA,一般建議至少固定6小時(shí)以上,18~24小時(shí)已可滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用,可依據(jù)染色結(jié)果增加固定時(shí)間與/或加入后固定的步驟。注:如固定時(shí)間到了無法繼續(xù)后續(xù)脫水、包埋程序,一定要將組織置換到PBS保存,切勿一直泡于固定液中。
b.?
增加固定液/組織比例,建議固定液體積至少要是組織塊的20倍體積。
c.?
準(zhǔn)備較小的組織塊(約3-4 mm),以迸行更完全的浸潤固定。
抗原修復(fù)過于強(qiáng)烈a.?憑經(jīng)驗(yàn)決定保留組織型態(tài)的條件,同時(shí)恢復(fù)抗原的免疫反應(yīng)性。理論上溫度越高,酸堿值越堿,但可能造成較高的背景值或組織型態(tài)破壞,因此,建議從92°C, pH?6開始嘗試,pH?6的抗原修復(fù)液即適用于大多數(shù)抗體。
b.?
使用冰凍切片樣本。冰凍切片一般不做抗原修復(fù),因?yàn)榭乖迯?fù)方式對冰凍切片可能太過強(qiáng)烈,也不需脫蠟、覆水等步驟,能夠較完好地保存細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)多種酶活性以及抗原的免疫活性。
切片組織細(xì)胞形成冰晶a.?防止組織中冰晶形成:
-
速凍使組織溫度驟降,?減少冰晶的形成。
-
固定后將組織置于20%~30%蔗糖溶液13天,利用高滲吸收組織中水分,?減少組織含水量,可防止或減少冰晶的形成。


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