炎癥小體：連接天然免疫和獲得性免疫
十五年前，炎癥小體（Inflammasome）的發(fā)現(xiàn)成為科學界了解炎癥發(fā)生的突破性研究1。炎癥小體被證明在不同的生理環(huán)境中起關鍵作用，因此成為藥物研發(fā)的重要靶點。本篇綜述集中討論炎癥小體在天然免疫和適應性免疫之間的中心作用。
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炎癥小體是由細胞質(zhì)傳感器，細胞凋亡相關斑點樣蛋白（ASC;或PYCARD）和pro-caspase-1組成的三體復合物。傳感器的多樣性和特異性賦予其對外源（微生物）或內(nèi)源（壓力信號，警報素）等各種刺激的響應。傳感器包括NLRP1，NLRP3和NLRC4（屬于NOD樣受體家族），AIM2（absent in melanoma-2）或Pyrin。多樣性和特異性的傳感器可以廣泛識別外源性（微生物分子）和內(nèi)源性（危險信號）刺激物。
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研究最為透徹的炎癥小體代表是NLRP3炎癥小體。其活化分兩步：第一個信號（Priming）觸發(fā)NF-κB依賴的pro-IL1β和NLRP3表達，第二個信號由不同結構的微生物分子（例如“毒素”）或危險信號（尿酸單鈉，MSU）觸發(fā)炎癥小體多聚體形成。NLRP3誘導ASC活化并形成斑點，進而促使caspase-1自我切割并活化?；罨腸aspase-1促使IL-1β和IL-18水解成熟；并且促使Gasdermin D（GSDMD）切割。切割的GSDMD隨后在細胞膜上形成孔，引發(fā)促炎性細胞死亡，即細胞焦亡（Pyroptosis）。這個過程伴隨著IL-1β，IL-18和警報素如HMGB1的釋放，將危險信號從受損或死亡的細胞傳播出去并調(diào)動免疫細胞，特別是體現(xiàn)在中性粒細胞的招募2,3。此外，寡聚炎性體顆?？赏ㄟ^吞噬作用（phagocytosis）被周圍巨噬細胞吞噬進而放大炎癥反應4。
有趣的是，在吞噬細胞處于“超活化（Hyperactivation）“狀態(tài)時，IL-1β的分泌可獨立于細胞焦亡的發(fā)生5,6。事實上，炎癥小體誘導樹突細胞（DCs）超活化，后者觸發(fā)增強T細胞（enhanced T cell）應答：除保留其功能和抗原遞呈外，增強T細胞促使微環(huán)境中的輔助T細胞（T helper）做出反應并分泌IL-1β和IL-18。這些細胞因子優(yōu)先驅動Th1、Th17應答。IL-18可通過活化的Th1細胞誘導IFN-γ產(chǎn)生，IL-1β可穩(wěn)定Th17細胞的分化，進而產(chǎn)生IL-17。此外，IL-1β也可提高初始T細胞和記憶T細胞的存活7,8。
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炎癥小體依賴性IL-1β分泌，可驅動Th17應答，對于防御真菌感染起到重要作用。通過C-型凝集素受體如Dectin-1識別Candida albicans等真菌抗原的特定結構（β-glucans）可導致Syk依賴性NF-κB的激活，NLRP3炎癥小體組裝和IL-1β驅動的Th17細胞應答9,10。值得注意的是，Dectin-1信號通路還可通過非經(jīng)典的caspase-8炎癥小體觸發(fā)產(chǎn)生IL-1β9。
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IL-1β和IL-18在獲得性免疫中的不同功能，使炎癥小體在疫苗佐劑的應用研究中備受關注。活化炎癥小體的配體可調(diào)控Th1型體液免疫應答，Th1、Th17、細胞毒性T細胞免疫和免疫記憶11。例如，由于I型干擾素（IFNs）可以抑制pro-IL-1合成，但促進IL-18成熟，所以將IFN與炎癥小體活化的DC混合，有希望保護Th1型應答11。最近研究發(fā)現(xiàn)，誘導I型干擾素的產(chǎn)生和NLRP3炎癥小體的活化可增強Th1型應答13。
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隨著對炎癥小體生物學機理的全面解析不斷深入，如何平衡選擇在有害和有益的炎癥小體激活之間切換，是未來優(yōu)化治療方案不得不考慮的課題。
炎癥小體報告基因細胞
InvivoGen開發(fā)了兩種THP-1衍生的報告細胞來輔助炎癥小體研究。THP-1是一種單核細胞系，也是炎癥小體體外（in vitro）活化研究中最常用的人源體系模型。在用炎癥小體誘導劑刺激之前，需進行啟動（priming）步驟以獲得IL-1β的最佳釋放效果。我們的THP-1衍生炎癥小體報告基因細胞可用于研究兩種炎癥小體介導的應答，細胞焦亡（caspase-1依賴性細胞死亡）和ASC斑點形成。
THP1-HMGB1-Lucia? Cells????NEW
THP1-HMGB1-Lucia Cells 是研究細胞焦亡特點獨特的工具，可對細胞焦亡進行穩(wěn)定而便捷的量化檢測。 該測定依賴于細胞溶解介導而釋放HMGB1的測量，后者是與Lucia螢光素酶融合的警報素蛋白。
??快速:?將細胞上清液與檢測試劑混合，即可測量熒光信號
? 靈敏:?本底低，LDH 測量范圍優(yōu)化
? 便捷:?只需要10 μl 細胞培養(yǎng)上清液 – 適合監(jiān)測動態(tài)變化
? 靈活:?可以評估細胞焦亡和IL-1β釋放
THP1-HMGB1-Lucia Cells需要在用炎癥小體誘導物如Nigericin和CPPD晶體（NLRP3誘導物）或poly（dA:dT）（AIM2誘導物）處理之前用LPS預處理。炎癥小體活化導致細胞焦亡介導質(zhì)膜破裂，從而釋放HMGB1 :: Lucia進入細胞培養(yǎng)液。加入檢測腔腸素底物的QUANTI-LucTM，可測量光信號強弱，從而監(jiān)測上清液中HMGB1 :: Lucia的水平。
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HMGB1::Lucia cell 的上清培養(yǎng)液也可通過IL-1β報告基因細胞，HEK-BlueTM?IL-1β檢測IL-1β的活性。此細胞攜帶NFkκB誘導性分泌型胚胎堿性磷酸酶（SEAP）報告基因，可通過加入檢測試劑QUANTI-BlueTM獲得相關數(shù)據(jù)。
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炎癥小體或以不同方式觸發(fā)細胞焦亡和IL-1β分泌：Nigericin是細胞焦亡快速，強效誘導劑，卻誘導產(chǎn)生少量IL-1β；而CPPD晶體不能觸發(fā)細胞焦亡，卻可以誘導產(chǎn)生高水平IL-1β。Poly(dA:dT)可同時強效誘導細胞焦亡和IL-1β分泌。
THP1-ASC-GFP Cells
THP1 ASC-GFP cells 穩(wěn)定表達ASC::GFP融合蛋白，后者可用于實時監(jiān)控ASC大蛋白復合物（specks）的形成。ASC::GFP的表達由NFkκB誘導性啟動子驅動，同時還需要LPS輔助啟動（priming）。因此，Poly(dA:dT)等配體活化炎癥小體可通過分析ASC specks的可視熒光信號來判斷。
Visualization of ASC speck formation by fluorescence microscopy:?THP1-ASC-GFP cells were primed with 1 μg/ml LPS-EK for 3 hours, inducing the expression of the ASC::GFP fusion protein in the cytoplasm (left panel). Cells were then incubated with 250 ng/ml complexed Poly(dA:dT) and ASC speck formation was monitored over 1 to 3 hours post-activation. In most cells, only one speck forms upon inflammasome activation (arrows in right pannel). Scale bar: 50 μm.
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| PRODUCT | QUANTITY | CAT.?CODE |
| THP1-HMGB1-LuciaTM?cells | 3-7?x?106?cells | thp-hmgluc |
| THP1-ASC-GFP?cells | 3-7?x?106?cells | thp-ascgfp |
| HEK-BlueTM?IL-1β?cells | 3-7?x?106?cells | hkb-il1b |
| CPPD | 5?mg | tlrl-cppd |
| Nigericin | 10?mg | tlrl-nig |
| Poly(dA:dT) | 200?μg | tlrl-patn |
炎癥小體抑制劑
InvivoGen提供多種阻斷炎癥小體免疫應答的抑制劑。這些抑制劑可作用于不同的靶點，如：NLRP3，AIM2或caspase-1。這些抑制劑通過THP1-HMGB1-Lucia cells驗證抑制炎癥小體的功效，也經(jīng)過HEK-Blue IL-1βcells驗證是否抑制IL-1β的活化。此外，我們通過檢測確保InvivoGen提供的炎癥小體抑制劑無細菌污染，阻止任何實驗偏差的發(fā)生。
| PRODUCT | MAIN?TARGET | QUANTITY | CAT.?CODE |
| Ac-YVAD-cmk | Caspase-1 | 5?mg | inh-yvad |
| MCC950 | NLRP3 | 10?mg | inh-mcc |
| ODN?TTAGGG?(A151) | AIM2 | 200?μg | tlrl-ttag151 |
| VX-765 | Caspase-1 | 10?mg | inh-vx765i-1 |
| Z-VAD-FMK | Pan-caspase | 1?mg | tlrl-vad |
炎癥小體抑制劑對THP1-HMGB1-Lucia? cells釋放IL-1β的抑制功效:?THP1-HMGB1-Lucia? cells由LPS啟動，隨后加入MSU (200 μμg/ml) 或轉染的Poly(dA:dT) (0.5 ml) 以及0.5 μμM的各種抑制劑。孵育過夜，取細胞上清加入HEK-Blue? IL-1β cells，孵育16小時。以QUANTI-Blue?檢測SEAP活性來判斷IL-1β 分泌水平。
Dectin-1a 和 Dectin-1b 報告基因細胞
InvivoGen最新推出一系列衍生自人類胚胎腎HEK293細胞系的Dectin-1報告細胞。 Dectin-1是一種C型凝集素受體（CLR），可識別真菌細胞壁中成份葡萄糖聚合物β-葡聚糖（β-glucans），因此在抗真菌天然免疫中發(fā)揮重要作用。
HEK-Blue? hDectin-1a Cells???NEW
HEK-Blue? hDectin-1b Cells??
HEK-Blue? mDectin-1b Cells??NEW
Dectin-1可被剪接成2種主要的同種型：全長A型和“無莖型（stalkless）”B型，二者不會對可溶性和顆粒狀β-glucans產(chǎn)生相同的反應1。小鼠RAW 264.7巨噬細胞內(nèi)源性同時表達兩種Dectin-1剪切型，但表達水平較低，而HEK293細胞不表達Dectin-1。因此，我們構建了穩(wěn)定過表達人源dectin-1a或-1b亞型和NF-κB誘導型分泌堿性磷酸酶（SEAP）的HEK-Blue細胞。這些細胞還完整構建Dectin-1信號通路所需誘導活化NF-κB的基因。
| PRODUCT | QUANTITY | CAT.?CODE |
| HEK-Blue??hDectin-1a?cells | 3-7?x?106?cells | hkb-hdect1a |
| HEK-Blue??hDectin-1b?cells | 3-7?x?106?cells | hkb-hdect1b |
| HEK-Blue??mDectin-1b?cells | 3-7?x?106?cells | hkb-mdect1b |
| HEK-Blue??Null?I-v?cells?(control) | 3-7?x?106?cells | hkb-null1v |
| QUANTI-Blue??(5?pouches) | 5?x?100?ml | rep-qb1 |
| Zymozan?(S.?cerevisiae) | 100?mg | tlrl-zyn |
| Laminarin?(L.?digitata) | 100?mg | tlrl-lam |
| WGP?dispersible?(S.?cerevisiae) | 50?mg | tlrl-wgp |
| WGP?soluble?(S.?cerevisiae) | 50?mg | tlrl-wgps |
| HKCA?(C.?albicans) | 109?cells | tlrl-hkca |
HEK-BlueTM?hDectin-1a、 -1b 和 HEK-BlueTM?Null I-v cells中，Dectin-1激動劑誘導NF-κB活化: 10 μg/ml Zymozan, Laminarin, WGP soluble, 100 μg/ml WGP dispersible, 或 3 x 106 cells/ml HKCA. 10 ng/ml TNF-α 為陽性對照。24小時后，以QUANTI-Blue?檢測SEAP活性來判斷NF-kκB活性。
盡管HEK-BlueTM?hDectin-1a細胞對顆粒和可溶性配體均有良好的響應，但HEK-BlueTM hDectin-1b細胞對顆粒配體的應答降低，對可溶性配體的應答極弱。 這與長期有爭議的可溶性配體如昆布多糖（laminarin）對Dectin-1的拮抗劑活性是一致的。 此外，這些結果進一步支持最近的報告，可溶性配體的大小和純度決定了它們的激動劑/拮抗劑活性2。 我們的細胞系能夠特異性測定可溶性和微粒化合物的生物活性。
1. Heinsbroek, S.E, et al, 2006. Expression of functionally different Dectin-1 isoforms by murine macrophages. J Immunol. 176: 5513. 2. Smith A.J., et al, 2018. Immunoregulatory activity of the natural product Laminarin varies widely as a result of its physicial properties. J Immunol. 200:788.
報告基因檢測試劑
QUANTI-Luc? Gold??NEW
優(yōu)化的Lucia和腔腸素熒光素酶檢測分析
? 檢測試劑盒包括兩種成份:?QUANTI-LucTM Plus 和 QLC Stabilizer
? 兩種選擇:?使用 QUANTI-Luc Plus
-不加入 QLC Stabilizer 可提高熒光信號強度
- 加入 QLC Stabilizer 可使熒光信號保持至少10分鐘的穩(wěn)定
? 高通量篩選的最佳選擇
? 可收集細胞上清液也可直接加入細胞中
QUANTI-LucTM?Gold是一種新型的報告基因檢測試劑盒，可用于檢測腔腸素酶型熒光素酶（如Lucia，Gaussia和Renilla螢光素酶）的活性。它包含QUANTI-LucTM?Plus，一種優(yōu)化的含腔腸素試劑和QLC穩(wěn)定劑。該試劑盒可實現(xiàn)靈活的螢光素酶活性測量：
（a）無QLC穩(wěn)定劑的QUANTI-LucTM?Plus可增強熒光信號光輸出的檢測（與標準QUANTI-LucTM相比）。
（b）加入QLC穩(wěn)定劑的QUANTI-LucTM?Plus可增強光信號穩(wěn)定性（超過10分鐘）。此選項非常適合高通量篩選或時間曲線研究。
加入QUANTI-LucTM Gold反應后發(fā)出的信號可使用光度計進行量化，以相對光單位（RLU）表示。
QUANTI-Luc系列檢測試劑檢測Lucia熒光素酶活性：用10 μg/ml 2’3’-cGAMP刺激THP1-Dual? cells 24小時。收集細胞上清液，用QUANTI-Luc?, QUANTI-Luc? Plus 或 QUANTI-Luc? Gold (QUANTI-Luc? Plus 含 QLC Stabilizer)檢測Lucia熒光素酶來判定ISG應答。持續(xù)10分鐘檢測相對光單位（RLUs）。
| PRODUCT | QUANTITY | CAT.?CODE |
| QUANTI-Luc??Gold | 1?pouch?(25?ml) 2?pouches?(50?ml) 5?pouches?(125?ml) 1?pouch?(500?ml) | rep-qlcg1 rep-qlcg2 rep-qlcg5 rep-qlcg-500 |
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| QUANTI-Luc? | 2?pouches?(50?ml)5?pouches?(125?ml)
1?pouch?(500?ml) | rep-qlc1 rep-qlc2 rep-qlc-500 |
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基因篩選抗生素
經(jīng)細胞培養(yǎng)檢測的抗生素
?無菌
?無內(nèi)毒素
?檢測功能活性
InvivoGen提供一系列經(jīng)過細胞培養(yǎng)測試的抗生素，以避免哺乳動物細胞在轉染過程中被非特異性篩選。InvivoGen抗生素無菌，無內(nèi)毒素，以避免細菌內(nèi)毒素對轉染細胞的有害作用。InvivoGen抗生素通過嚴格的物理化學，微生物和細胞測試以確保生物功能活性。InvivoGen保證其篩選抗生素對哺乳動物細胞表現(xiàn)出長期培養(yǎng)的穩(wěn)定性，且沒有細胞毒性。
| PRODUCT | QUANTITY | CAT.?CODE |
| Blasticidin | 100?mg?(10?x?1?ml) | ant-bl-1 |
| G418?(Geneticin) | 1?g?(10?x?1?ml) | ant-gn-1 |
| Hygromycin?B?Gold? | 1?g?(10?x?1?ml) | ant-hg-1 |
| Puromycin | 100?mg?(10?x?1?ml) | ant-pr-1 |
| Zeocin? | 1?g?(10?x?1?ml) | ant-zn-1 |
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